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酵母フェロモン応答シグナルを用いたタンパク質間相互作用解析法の開発

利用酵母信息素响应信号开发蛋白质-蛋白质相互作用分析方法

基本信息

批准号：
08J00945
负责人：
福田展雄
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

酵母一倍体はフェロモンを感知すると二倍体を形成(接合)する。この接合を誘導するシグナルは細胞内のGα、Gβ、Gγから構成されるGタンパク質を介して下流へと伝達されていくが、Gνの膜局在性が不可欠である。そこで遺伝子工学的にGγの膜結合部位を削除することでシグナルを欠失させたのち、タンパク質間相互作用を用いてこれを回復させる手法を考案した。本年度は微弱な相互作用の検出をも可能とするために野生型Gνをエンハンサーとしたシグナル増幅技術の確立を試みた。本研究では微弱なタンパク質間相互作用のモデルとして、ヒトIgGのFc部位およびStaphylococcus aureusプロテインA由来のZ_<131A>(結合定数8.0×10^3M^<-1>)を選択した。従来技術とエンハンサーを用いた新技術のシグナル応答レベルを比較した結果、Fc-Z_<131A>の相互作用に対して約20,000倍のシグナル増幅が可能であることが示された。またエンハンサーをGβに変更することで新たな応用を考案した。シグナル伝達を誘導する物質(アゴニスト)は創薬リード化合物となるが、酵母での検出技術ではシグナル応答レベルが低いことが課題とされている。本技術の導入によりアゴニスト存在下では初期には微弱ながらもシグナル応答としてGβの過剰発現がフィードバック的に促進され、非常に大きなシグナル応答レベルが得られる。本研究ではソマトスタチンをアゴニストのモデルとして選択した。従来技術と比較した結果、検出下限濃度は10分の1に改善され、最大シグナル応答レベルは約3倍に上昇した。以上の結果より、本シグナル増幅技術は微弱な相互作用の検出およびアゴニストの高感度検出に有効であることが示された。

Yeast ploidy senses the formation (conjugation) of diploid.このJointing を induced するシグナルは Gα, Gβ, Gγ から constitute されるGタンパク性を解して无码へと伝达されていくが, Gνの电影bureau in sex がcannot owe である.そこで伝子工公's にGγのmembrane bonding part is cut off することでシグナルを无码せたのち、タンパク Interaction between materials を Use いてこれを to reply させる Technique を Examination case した. This year, it is possible to test the wild-type Gνをエンハンサーとしたシグナルamplification technology by establishing a weak interaction. In this study, the weak inter-plasmic interaction and the Fc site of IgG and Staphylococcus aureusプロテインA originのZ_<131A> (combination fixed number 8.0×10^3M^<-1>)を选択した.哓来技术とエンハンサーを用いたNew technologyのシグナル応responderレベルをComparisonした results, Fc-Z_< 131A> The interaction is about 20,000 times larger than the original size, and the interaction is possible.またエンハンサーをGβに変change することで新たな応用を考级した.シグナル伝达をinducing substance (アゴニスト) は成薬リード compound となるが, Yeast での検出技术ではシグナル応respond レベルがlow いことがproject とされている. The introduction of this technology was carried out in the early stages of the introduction of this technology. The に大きなシグナル応respond レベルが got られる of the の过剰発appears ドバック's にstimulation. This study is based on the selection of ではソマトスタチンをアゴニストのモデルとして. As a result of technical comparison, the lower limit concentration was improved by 10 minutes, and the maximum concentration was increased by about 3 times. As a result of the above, our amplification technology shows that weak interactions and high sensitivity are effective and efficient.