酵母フェロモン応答シグナルを用いたタンパク質間相互作用解析法の開発

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酵母一倍体はフェロモンを感知すると二倍体を形成(接合)する。この接合を誘導するシグナルは細胞内のGα、Gβ、Gγから構成されるGタンパク質を介して下流へと伝達されていくが、Gνの膜局在性が不可欠である。そこで遺伝子工学的にGγの膜結合部位を削除することでシグナルを欠失させたのち、タンパク質間相互作用を用いてこれを回復させる手法を考案した。本年度は微弱な相互作用の検出をも可能とするために野生型Gνをエンハンサーとしたシグナル増幅技術の確立を試みた。本研究では微弱なタンパク質間相互作用のモデルとして、ヒトIgGのFc部位およびStaphylococcus aureusプロテインA由来のZ_<131A>(結合定数8.0×10^3M^<-1>)を選択した。従来技術とエンハンサーを用いた新技術のシグナル応答レベルを比較した結果、Fc-Z_<131A>の相互作用に対して約20,000倍のシグナル増幅が可能であることが示された。またエンハンサーをGβに変更することで新たな応用を考案した。シグナル伝達を誘導する物質(アゴニスト)は創薬リード化合物となるが、酵母での検出技術ではシグナル応答レベルが低いことが課題とされている。本技術の導入によりアゴニスト存在下では初期には微弱ながらもシグナル応答としてGβの過剰発現がフィードバック的に促進され、非常に大きなシグナル応答レベルが得られる。本研究ではソマトスタチンをアゴニストのモデルとして選択した。従来技術と比較した結果、検出下限濃度は10分の1に改善され、最大シグナル応答レベルは約3倍に上昇した。以上の結果より、本シグナル増幅技術は微弱な相互作用の検出およびアゴニストの高感度検出に有効であることが示された。