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F-boxタンパク質-基質関係の網羅的探索方法の確立、およびその生理的機能解析

F-box蛋白-底物关系综合检索方法的建立及其生理功能分析

基本信息

批准号：
08J01006
负责人：
弓本佳苗
金额：
$ 0.77万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

1.網羅的基質同定法の確立本研究では、全てのF-boxタンパク質に応用可能な網羅的基質同定法の構築を目標としている。このため、最初にモデル系として既に酵素-基質関係が明らかになっているSkp2-p27系(F-boxタンパク質=Skp2、その基質分子=p27)を用いて結合条件の最適化を行った。この結合をベースとした方法の欠点は、F-boxタンパク質と基質が結合すると基質分子は速やかに分解されてしまうということだったが、Skp2のF-boxドメインへ特殊な点変異を導入することにより、p27とは結合するが分解しない状況を作り上げることに成功し、この問題を克服した。また、逆にこの性質を利用して野生型と変異型Skp2への結合性の差異を定量的プロテオーム解析法であるSILAC法で測定することにより、容易にp27を含む基質候補分子の同定が可能となった。2.新規基質探索への応用次に、別のモデル系であるFbxw7-c-Myc系(F-boxタンパク質=Fbxw7、その基質分子=c-Myc)を用いてMFAS法の適応を検討した。その結果、MEAS法で変異型Fbxw7特異的に結合するタンパク質として、既知の基質であるc-Mycを同定した。この他にも、Fbxw7の基質認識配列を含んだ13つの新規基質候補分子を同定した。このうち3つの基質候補について解析を行い、実際に基質であることを確認した。これらの3つの新規基質はそれぞれ骨・軟骨・脂肪への分化に必要なことが報告されているが、分化実験の結果からFbxw7が実際に新規基質の分解を介して間葉系の分化に重要な働きをしていることを示した。3.新規F-boxタンパク質への応用MFAS法は全てのF-boxタンパク質に応用可能である。われわれのグループはMEAS法を用いて現在約5種類の新規F-boxタンパク質の基質同定を始めており、既知の基質を含めて複数の新規基質を同定している。また現在Cul2、Cul3、Cul4複合体のユビキチンリガーゼについても基質同定を試みており、新規基質について精力的に解析を行っている。今後は複合体型のユビキチンリガーゼだけではなく、単分子型のユビキチンリガーゼについても同様に結合を指標にした解析を行うべく解析を始めている。

1. The establishment of matrix identity method for network in this study is aimed at the establishment of matrix identity method for network in all aspects. The Skp2-p27 system (F-box protein = Skp2, substrate molecule =p27) was optimized by using medium binding conditions. The method of binding is to overcome the problem of binding, decomposition and separation of matrix molecules. The properties of p27-containing matrix candidate molecules can be determined by SILAC analysis using the difference in binding properties between wild-type and heterotypic Skp2 molecules. 2. The new matrix exploration method was used to explore the sub-system and the different matrix molecules such as Fbxw7-c-Myc system (F-box type = Fbxw7, matrix molecule =c-Myc). As a result, the MEAS method identified a heterotypic Fbxw7-specific binding protein that was identical to c-Myc in a known matrix. The matrix recognition and alignment of Fbxw7 includes 13 new matrix candidate molecules. The matrix candidate is analyzed in the middle of the line, and the matrix is confirmed. The new matrix is necessary for differentiation of bone, cartilage and fat. The results of differentiation are reported in Fbxw7. The decomposition of new matrix is important for differentiation of mesenchymal system. 3. The new F-box quality control system uses the MFAS method to completely control the F-box quality control system. There are about 5 kinds of new F-box types in MEAS method, which are used in the initial stage, known stage and new stage. Cul2, Cul3 and Cul4 complexes are now in the process of matrix identification and matrix analysis. In the future, the complex type will be divided into two groups: the first group and the second group.