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イノシトールリン脂質代謝機構のFRETプローブを用いた時空間的解析

利用FRET探针时空分析肌醇磷脂代谢机制

基本信息

批准号：
08J03305
负责人：
西岡照子
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2010
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08J03305/
关键词：
FRET ホスファチジン酸イノシトールリン脂質

项目摘要

ホスファチジン酸(PA)は形質膜を構成するリン脂質の一種であり、細胞の生存や増殖、形態形成に関与することが知られている。PAはPLDまたはDAGKによって産生されることが報告されているが、生細胞内での産生代謝の時空間情報は明らかにされていない。そこで本研究では、生細胞の形質膜上でのPAの局在を検出するFRETプローブを初めて開発し、FRETプローブを用いてリアルタイムに観察することでPAの代謝制御機構を解析した。本研究では、PAをモニターするFRETプローブPiiを新規に作製した。このプローブは、N末端よりシアン色蛍光蛋白質、PA結合蛋白質のPA結合領域(DOCK2のC末端領域)、黄色蛍光蛋白質、K-Rasの形質膜局在化信号からなり、プローブのPA結合領域が形質膜のPAと結合するとCFP/FRETで表されるFRET効率が上昇するようにデザインされている。Pii発現細胞では、合成PAの添加、PLDあるいはDAGKの形質膜上での活性化によってFRET効率の上昇が観察されたことから、PiiがPAを検出していることを示した。そして、形質膜上のPAの量は同じ細胞株でも個々の細胞によって異なるのと同様、異なる細胞株間でも多様であることも明らかにした。さらに興味深いことに、増殖因子によって増加するPAの量は刺激前のPAの量に逆相関したことから、形質膜にはPAの濃度の上限があることが示唆された。また、細胞形質膜上のPAの局在は不均一であり、増殖因子刺激の前後ともにPAは細胞間接触領域よりも細胞の自由縁に集積していることも初めて明らかにした。細胞間接触部位では、細胞運動や細胞増殖に関与する低分子量G蛋白質Rasの活性が低いこと、低分子量G蛋白質はPLDを活性化すること、PLDの代謝産物であるPAがDAGKを活性化することが既に報告されていた。したがって、細胞間接触領域でPAがRasの活性を空間的に制御していることが示唆された。

The monolayer of maleic acid (PA) forms a kind of lipid, cell survival colonization, morphological formation and genetic transformation. PA, PLD, DAGK, health reports, reports and reports. In this study, on the cell membrane, the PA office is responsible for the opening of the FRET system, and the FRET system is used to monitor the PA system. In this study, the new regulations of PA, PA, FRET, Pii, etc. Fluorescent protein, N-terminal phosphoprotein, PA-binding protein, PA binding field (DOCK2 C-terminal domain), yellow phosphoprotein, K-Ras thin film, chemical signal, PA binding field, PA, CFP/FRET, FRET, CFP/FRET, FRET, CDK2, CDCK2, DOCK2, DOCK2, DOC Pii showed cell size, synthetic PA was added, PLD was activated, FRET was added, and Pii PA was displayed on the membrane. The amount of PA on the cell membrane was the same as that of the two cell lines, and the cell-to-cell temperature was the same as that of the two cell lines. The amount of PA before stimulation, the amount of PA in reverse phase, the upper limit of the degree of PA in the shape of the membrane, the upper limit of the concentration of PAA, the amount of PAI, the amount of PAI, the amount of PAA, the amount of PAI, the amount of PAA, the amount of PA The PA office on the cell membrane was used to determine the field of intercellular contact of PA cells before and after stimulation of heterogeneity and colonization factors. Low molecular weight G protein, low molecular weight G protein Ras activity, low molecular weight G protein, low molecular weight G protein, The control and control devices in the PA Ras active space in the field of intercellular contact indicate that they are instigated.