イノシトールリン脂質代謝機構のFRETプローブを用いた時空間的解析

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ホスファチジン酸(PA)は形質膜を構成するリン脂質の一種であり、細胞の生存や増殖、形態形成に関与することが知られている。PAはPLDまたはDAGKによって産生されることが報告されているが、生細胞内での産生代謝の時空間情報は明らかにされていない。そこで本研究では、生細胞の形質膜上でのPAの局在を検出するFRETプローブを初めて開発し、FRETプローブを用いてリアルタイムに観察することでPAの代謝制御機構を解析した。本研究では、PAをモニターするFRETプローブPiiを新規に作製した。このプローブは、N末端よりシアン色蛍光蛋白質、PA結合蛋白質のPA結合領域(DOCK2のC末端領域)、黄色蛍光蛋白質、K-Rasの形質膜局在化信号からなり、プローブのPA結合領域が形質膜のPAと結合するとCFP/FRETで表されるFRET効率が上昇するようにデザインされている。Pii発現細胞では、合成PAの添加、PLDあるいはDAGKの形質膜上での活性化によってFRET効率の上昇が観察されたことから、PiiがPAを検出していることを示した。そして、形質膜上のPAの量は同じ細胞株でも個々の細胞によって異なるのと同様、異なる細胞株間でも多様であることも明らかにした。さらに興味深いことに、増殖因子によって増加するPAの量は刺激前のPAの量に逆相関したことから、形質膜にはPAの濃度の上限があることが示唆された。また、細胞形質膜上のPAの局在は不均一であり、増殖因子刺激の前後ともにPAは細胞間接触領域よりも細胞の自由縁に集積していることも初めて明らかにした。細胞間接触部位では、細胞運動や細胞増殖に関与する低分子量G蛋白質Rasの活性が低いこと、低分子量G蛋白質はPLDを活性化すること、PLDの代謝産物であるPAがDAGKを活性化することが既に報告されていた。したがって、細胞間接触領域でPAがRasの活性を空間的に制御していることが示唆された。