インポーティンベータ依存的核-細胞質間物質輸送の新規メカニズムの解明

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本研究では、インポーティンベータの核膜孔複合体通過機構に対し、Ranや新たに同定したIBBP1がどのような役割を果たしているか解明することを目的としている。本年度は、当初の研究計画に従い、核膜孔を通過するインポーティンβのin vivo一分子観察、について研究を進めた。invivoでのインポーティンβの核内・核外移行の動態を解析するために、GFPタグ付きインポーティンベータを発現したHeLa生細胞の核全体にレーザーを照射し、消光されなかったインポーティンベータが核内へ輸送される様子を蛍光顕微鏡で経時観察した。インポーティンβの核内への蓄積のキネティクスは指数関数によくフィットするものであり、微分方程式を元にした数学的解析から核内・核外移行の速度定数をそれぞれ求めることに成功した。これらの解析手法により、IBBP1やRan、輸送基質がインポーティンベータの核内・核外移行へ及ぼす影響の定量的な解析が可能となった。また、昨年度から引き続きマイクロガラスピペットを用いた核膜孔一分子輸送解析系の開発も行った。原子間力顕微鏡により、HeLa細胞の核膜孔の密度と、隣り合う核膜孔間の距離を測定し、核膜孔一分子のみをとらえることができるガラスピペットの先端径を算出した後、プラーを用いて目的の先端径(300ナノメートル)のガラスピペットを作成する技術を獲得した。作成したガラスピペットにGFPタグ付きインポーティンベータを充填させ、基板上に露出させた核の上に静置したところ、インポーティンベータがピペット内の核膜孔を通過し核内へ輸送される様子が観察された。これにより、インポーティンベータの核内・核外移行の動態と、それに対してIBBP1やRanが及ぼす影響を、核膜孔一分子レベルで解析することが可能となった。