合成化学的アプローチに立脚した電位依存性プロトンチャネルの機能発現機構の解析

基于合成化学方法分析电压门控质子通道的功能表达机制

• 批准号: 08J05963
• 负责人: 中村 健一郎
• 金额: $ 0.77万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08J05963/
• 关键词: ペプチド合成; 電位依存性プロトンチャネル; ライゲーション; ペプチドチオエステル; 膜タンパク質; 脂質二重膜

電位依存性プロトンチャネル(VSOP/Hv)は4回膜貫通型のタンパク質であり、膜電位依存的にプロトンを透過させる機能を有している。申請者はVSOPの膜電位依存的な構造変化を固体NMRにより解析し、その機能発現機構の解明を行うことを目的としている。本年度はVSOPの化学合成法と活性評価法についての研究を行った。機能発現最小ユニットであるVSOP(78-222)の合成は、固相合成法により調製したVSOP(78-120)、VSOP(121-157)、VSOP(158-222)それぞれをチオエステル法により縮合(ライゲーション)することにより達成した。しかし、合成したVSOP(78-222)の収率は非常に低いものであった。そこで効率の良い合成を実現するため低収率の原因の解明に取り組んだ結果、膜貫通部位を含むペプチドは固相担体に結合した状態や凍結乾燥した状態での保存、保護基の導入、チオエステルへの変換の際に徐々に会合体を形成し、反応性が低下することを明らかにした。この問題を解決するために、会合が抑制された条件下で、合成ブロックであるペプチドチオエステルを調製することを検討し、チオエステル結合をワンポットで形成する新規合成法を開発した。次に化学合成したVSOPを脂質二重膜中にフォールディングし、機能活性評価系を立ち上げた。具体的にはVSOPが膜を介して一方向にプロトンを透過させることにより生じる膜内外のpH変化をACMAという蛍光物質を用いて測定した。これまでに発現VSOPを用いてこの評価系が有効に機能することを確認した。当初、VSOPの機能発現機構の解析を行うことを目的としていたが、膜タンパク質の合成には未解明の現象が散見され目的を達成することは出来なかった。しかし、チオエステル法を用いて4回膜貫通型タンパク質の合成を世界に先駆けて行い、本合成を通して膜タンパク質の一般的な取り扱い方を開発するための重要な足掛かりを得ることができた。

Potential-dependent switching (VSOP/Hv) is a 4-loop membrane-through-type switching function, and a membrane-potential-dependent switching function. The applicant is interested in the analysis of VSOP membrane potential-dependent structural changes and the interpretation of functional discovery mechanisms. This year, the chemical synthesis method and activity evaluation method of VSOP were carried out. The synthesis of VSOP (78-222), VSOP (78-120), VSOP(121-157) and VSOP (158-222) by solid phase synthesis method, and the synthesis of VSOP(78 -222) by solid phase synthesis method were carried out. VSOP(78-222) has a very low reflection rate. The reason for the low yield is explained by the combination of the results, the membrane penetration site, the solid support, the combination state, the freeze-drying state, the introduction of the protective group, the transformation of the reaction, the formation of the reaction, and the reduction of the reaction. The new synthesis method is developed under the condition that the problem is solved and the convergence is suppressed. The second is chemical synthesis of VSOP lipid double membrane, functional activity evaluation system. The specific VSOP membrane is measured in one direction, and the pH inside and outside the membrane is measured in one direction. The VSOP is available for evaluation and validation. At the beginning, the function of the VSOP is to analyze the purpose, the film quality is to synthesize the phenomenon, and the purpose is to achieve the purpose. The method of synthesis of the four layers of membrane through the quality of the synthesis of the world's first line, the synthesis of the membrane through the quality of the general selection of the development of the important foot hanging

项目成果

Peptide purification by affinity chromatography based on α-ketoacyl group chemistry

• DOI: 10.1002/psc.1127
• 发表时间: 2009-05-01
• 期刊: JOURNAL OF PEPTIDE SCIENCE
• 影响因子: 2.1
• 作者: Hara, Toshiaki;Tainosho, Akira;Aimoto, Saburo
• 通讯作者: Aimoto, Saburo

Synthetic Method of Peptide Thioester in Fmoc Chemistry Based on an N-S Acyl Shift Reaction

基于N-S酰基转移反应的Fmoc化学肽硫酯合成方法

• 发表时间: 2008
• 作者: Hara;Toshiaki;Tainosho;Akira;Sato Takeshi;Nakamura;Ken'ichiroh;Kawakami;Toru;Aimoto;Saburo;中村健一郎;中村健一郎;田結荘明;相本三郎
• 通讯作者: 相本三郎

Peptide Purification Using The Selective Reaction Between Aminooxy Group and Isothiocyanate Group, Followed by Edman Degradation.

利用氨氧基和异硫氰酸酯基团之间的选择性反应进行肽纯化，然后进行 Edman 降解。

• 发表时间: 2009
• 期刊: Peptide Science 2008 (In press)
• 作者: Toshiaki Hara;Akira Tainosho;Ken'ichiroh Nakamura;Takeshi Sato;Toru Kawakami;Saburo Aimoto;荒木大輔;中西希;佐藤亜希子;T. Hara;A. Tainosho
• 通讯作者: A. Tainosho

Study on Synthesis of Voltage-dependent Proton Channel(VSOP/Hv)Based on the Thioester Method

基于硫酯法合成电压依赖性质子通道(VSOP/Hv)的研究

• 发表时间: 2009
• 作者: Nakamura;Ken'ichiroh;Hara;Toshiaki;Tamagaki;Hiroko;Akai Yuichi;Sato;Takeshi;Kawakami;Toru;Yasushi;Aimoto;Saburo
• 通讯作者: Saburo

電位依存性プロトンチャネル(VSOP)合成法の研究

电压门控质子通道（VSOP）合成方法研究

• 发表时间: 2009
• 作者: Hara;Toshiaki;Tainosho;Akira;Sato Takeshi;Nakamura;Ken'ichiroh;Kawakami;Toru;Aimoto;Saburo;中村健一郎
• 通讯作者: 中村健一郎