合成化学的アプローチに立脚した電位依存性プロトンチャネルの機能発現機構の解析

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電位依存性プロトンチャネル(VSOP/Hv)は4回膜貫通型のタンパク質であり、膜電位依存的にプロトンを透過させる機能を有している。申請者はVSOPの膜電位依存的な構造変化を固体NMRにより解析し、その機能発現機構の解明を行うことを目的としている。本年度はVSOPの化学合成法と活性評価法についての研究を行った。機能発現最小ユニットであるVSOP(78-222)の合成は、固相合成法により調製したVSOP(78-120)、VSOP(121-157)、VSOP(158-222)それぞれをチオエステル法により縮合(ライゲーション)することにより達成した。しかし、合成したVSOP(78-222)の収率は非常に低いものであった。そこで効率の良い合成を実現するため低収率の原因の解明に取り組んだ結果、膜貫通部位を含むペプチドは固相担体に結合した状態や凍結乾燥した状態での保存、保護基の導入、チオエステルへの変換の際に徐々に会合体を形成し、反応性が低下することを明らかにした。この問題を解決するために、会合が抑制された条件下で、合成ブロックであるペプチドチオエステルを調製することを検討し、チオエステル結合をワンポットで形成する新規合成法を開発した。次に化学合成したVSOPを脂質二重膜中にフォールディングし、機能活性評価系を立ち上げた。具体的にはVSOPが膜を介して一方向にプロトンを透過させることにより生じる膜内外のpH変化をACMAという蛍光物質を用いて測定した。これまでに発現VSOPを用いてこの評価系が有効に機能することを確認した。当初、VSOPの機能発現機構の解析を行うことを目的としていたが、膜タンパク質の合成には未解明の現象が散見され目的を達成することは出来なかった。しかし、チオエステル法を用いて4回膜貫通型タンパク質の合成を世界に先駆けて行い、本合成を通して膜タンパク質の一般的な取り扱い方を開発するための重要な足掛かりを得ることができた。