電位依存性プロトンチャネルHv1/VSOPによる酸化ストレス抑制機能の解明

本実験では、Hv1/VSOPによる抗酸化ストレス作用を明らかにするために、活性酸素を作る酵素であるNADPHオキシダーゼによる酸化ストレス作用に着目して実験を行った。初年度はHv1/VSOPによるNADPHオキシダーゼを制御する機構に着目して実験を行った。具体的には、Hv1/VSOPがNADPHオキシダーゼの数の制御に関わる可能性を検証するためにビオチン化法により細胞膜上に発現するNADPHオキシダーゼの定量を試みた。まず、好中球走化性因子であるfMLFで好中球を刺激すると細胞膜にNADPHオキシダーゼがリクルートされることを利用して、マウス骨髄から単離した好中球をfMLF刺激した後、ビオチン化法により細胞膜上に局在するNADPHオキシダーゼを回収した。刺激していない好中球に対してもビオチン化法により細胞膜上のNADPHオキシダーゼを回収し、NADPHオキシダーゼの抗体を用いたウェスタンブロット法で発現を調べた。その結果、fMFL刺激された好中球においてNADPHオキシダーゼのバンドが検出された。ビオチンのみではNADPHオキシダーゼは検出されなかった。一方で、刺激していない好中球においてはNADPHオキシダーゼのバンドは検出されたものの非常に低レベルの発現であることが示唆された。すなわち、ビオチン化法により細胞膜上のNADPHオキシダーゼを検出することができること、そして局在レベルを定量化できることが分かった。

本実験では、Hv1/VSOPによる抗酸化ストレス作用を明らかにするために、活性酸素を作る酵素であるNADPHオキシダーゼによる酸化ストレス作用に着目して実験を行った。初年度はHv1/VSOPによるNADPHオキシダーゼを制御する機構に着目して実験を行った。具体的には、Hv1/VSOPがNADPHオキシダーゼの数の制御に関わる可能性を検証するためにビオチン化法により細胞膜上に発現するNADPHオキシダーゼの定量を試みた。まず、好中球走化性因子であるfMLFで好中球を刺激すると細胞膜にNADPHオキシダーゼがリクルートされることを利用して、マウス骨髄から単離した好中球をfMLF刺激した後、ビオチン化法により細胞膜上に局在するNADPHオキシダーゼを回収した。刺激していない好中球に対してもビオチン化法により細胞膜上のNADPHオキシダーゼを回収し、NADPHオキシダーゼの抗体を用いたウェスタンブロット法で発現を調べた。その結果、fMFL刺激された好中球においてNADPHオキシダーゼのバンドが検出された。ビオチンのみではNADPHオキシダーゼは検出されなかった。一方で、刺激していない好中球においてはNADPHオキシダーゼのバンドは検出されたものの非常に低レベルの発現であることが示唆された。すなわち、ビオチン化法により細胞膜上のNADPHオキシダーゼを検出することができること、そして局在レベルを定量化できることが分かった。