胸腺プロテアソームによる免疫制御機構の解明

胸腺蛋白酶体免疫控制机制的阐明

• 批准号: 08J08583
• 负责人: 佐々木 克博
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2010
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08J08583/
• 关键词: 胸腺プロテアソーム; β5t; ポジティブセレクション; MHC class I; ペプチド; プロテアソーム; 胸腺

前年度、β5t発現細胞株を用いて胸腺プロテアソーム依存的に生成されるMHCclassI結合性ペプチドを同定した。これらのペプチドのアミノ酸配列の解析から特定の位置に一定のアミノ酸が頻出することが明らかとなり、本年度ではこれらの結果を裏付けるために胸腺プロテアソームによる基質分解アッセイを行いさらなる解析を進めた。プロテアソームによって容易に分解されるβ-caseinやenolase, ovalbumin等をアフィニティー精製で得られた胸腺プロテアソームへと加え、37℃で反応させた。その後、限外濾過により分解産物のみ抽出し、nanoflow-LC-TOF-MS/MSにより夫々のペプチドの配列を決定した。これらの分解産物の解析からβ5tによって選択的に生じる切断部位を見出すことができた。これらの切断部位付近のアミノ酸配列の解析結果は、MHCclassI結合性ペプチドの同定で明らかとなったアミノ酸の特徴と酷似しており、β5tがアミノ酸配列を認識してタンパク質の分解を行っていることを初めて強く示唆した。β5tを構成因子とする胸腺プロテアソームが作り出したペプチドが胸腺におけるCD8T細胞のポジティブセレクションに必要であるという仮説を提起する為に現時点で最も重要な結果を得ることができたと考えている。さらにこれらのペプチドがT細胞の胸腺内分化に影響するかを解析するために、そのアッセイ系の確立を行った。ペプチドの影響を明確にするためにOTIやP14,HYのT細胞受容体トランスジェニックマウスを導入し、これらのマウスを用いてfetal thymus organ culture (FTOC)を行った。現在このFTOCにおいてペプチドを加えることでT細胞の分化が誘導されるかを試みている。期待する結果が得られたならば胸腺におけるポジティブセレクションがベプチド誘導性であることを初めて証明することになる。

Before the annual 発, beta 5 t cell lines を now use い て thymus プ ロ テ ア ソ ー ム dependent に generated さ れ る MHCclassI associativity ペ プ チ ド を with fixed し た. こ れ ら の ペ プ チ ド の ア ミ ノ acid with column の parsing か ら に の position must be specific の ア ミ ノ acid が mount す る こ と が Ming ら か と な り, this year's で は こ れ ら の result in pay け を る た め に thymus プ ロ テ ア ソ ー ム に よ る matrix decomposition ア ッ セ イ を line い さ ら な る parsing を into め た. プ ロ テ ア ソ ー ム に よ っ て に easily decomposed さ れ る beta casein や enolase, ovalbumin and を ア フ ィ ニ テ ィ ー refined で have ら れ た thymus プ ロ テ ア ソ ー ム へ と え, 37 ℃ で anti 応 さ せ た. そ の, limit after filtration に よ り decomposition product の み spare し, nanoflow - LC - TOF - MS/MS に よ り husband 々 の ペ プ チ ド の match column を decided し た. こ れ ら の decomposition product の parsing か ら beta 5 t に よ っ て sentaku に born じ る を see cut parts out す こ と が で き た. こ れ ら の cut parts pay nearly の ア ミ ノ acid with analytical results は の, MHCclassI associativity ペ プ チ ド の with fixed で Ming ら か と な っ た ア ミ ノ acid の, 徴 と resembles し て お り, beta 5 t が ア ミ ノ acid with column を know し て タ ン パ ク mass line の decomposition を っ て い る こ と を early め て く and shown strong sucking し た. Beta 5 t を constitute factor と す る thymus プ ロ テ ア ソ ー ム が as り out し た ペ プ チ ド が thymus に お け る CD8T cells の ポ ジ テ ィ ブ セ レ ク シ ョ ン に necessary で あ る と い う 仮 said を filed す る で for に now dot the result of the most important な も を る こ と が で き た と exam え て い る. さ ら に こ れ ら の ペ プ チ ド が t-cell の dispersion に thymus す る か を parsing す る た め に, そ の ア ッ セ イ line is の established を っ た. ペ プ チ ド の influence を clear に す る た め に the OTI や P14, HY の T cells by the capacity of body ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス を import し, こ れ ら の マ ウ ス を with い て fetal thymus outraged culture (FTOC) line を っ た. Now こ の FTOC に お い て ペ プ チ ド を plus え る こ と で differentiation が の T cells induced さ れ る か を try み て い る. The result of expect す る が ら れ た な ら ば thymus に お け る ポ ジ テ ィ ブ セ レ ク シ ョ ン が ベ プ チ ド induced で あ る こ と を early め て prove す る こ と に な る.

项目成果

Regulation of intrathymic peptide production by the thymus-specific proteasome subunit β5t

胸腺特异性蛋白酶体亚基 β5t 对胸腺内肽产生的调节

• 发表时间: 2010
• 作者: Murakami H;Matsunaga M;Ohira H;佐々木克博;佐々木克博
• 通讯作者: 佐々木克博

Genetic analysis of proteasome assembling chaperone 1 (PAC1) in mice

小鼠蛋白酶体组装伴侣 1 (PAC1) 的遗传分析

• 发表时间: 2008
• 作者: Murakami H;Matsunaga M;Ohira H;佐々木克博;佐々木克博;佐々木克博
• 通讯作者: 佐々木克博

PAC1 Gene Knockout Reveals an Essential Role of Chaperone-Mediated 20S Proteasome Biogenesis and Latent 20S Proteasomes in Cellular Homeostasis

• DOI: 10.1128/mcb.00216-10
• 发表时间: 2010-08-01
• 期刊: MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY
• 影响因子: 5.3
• 作者: Sasaki, Katsuhiro;Hamazaki, Jun;Murata, Shigeo
• 通讯作者: Murata, Shigeo