中性子と高分解能X線結晶構造解析によるタンパク質の水素原子を介した相互作用の解明

点击翻译按钮获取中文摘要

本研究では光受容タンパク質Photoactive Yellow Protein(PYP)をモデルタンパク質として、中性子結晶構造をもとに機能発現機構における水素原子の役割を明らかにすることを目的としている。昨年度の研究においては、野生型PYPの発色団(pCA)-E46間に形成された低障壁水素結合を観測し、タンパク質における低障壁水素結合の形成を初めて実証した(Yamaguchi S. et al. 2009, PNAS)。本年度の研究では、低障壁水素結合形成部位、及びその周辺に変異を加えたE46Q,Y42F変異体の中性子回折実験用結晶の調製、及び中性子結晶構造解析を行った。E46Q:PYPの結晶化に関する相図をもとに結晶化条件のスクリーニングを行い、最適な結晶化条件を得た。その結果5.1x1.2x0.7mm^3の結晶が得られ、この結晶を用いて日本原子力研究開発機構において中性子回折実験を行った。露光時間4時間で221枚の回折パターンを測定した。このデータセットは分解能1.5Åで処理することができた。中性子回折実験後、同じ結晶を用いてPFにおいて室温のX線回折実験を行い、分解能1.30Åのデータセットを得た。得られた中性子/X線両方のデータを併用して構造解析を行った結果、分解能1.5Å、信頼度因子R/Rfree=19.6%/21.8%で水素原子を含む立体構造を構築した。Y42F:これまでの研究よりY42F変異体では、吸収極大波長が446nmから458nmまで長波長シフトした上、380nmにショルダーが観測されることがわかっている。このことから、Y42FにおいてはpCA-E46間の低障壁水素結合に、何らかの変化が生じていると考えられる。しかし、これまでに報告されているY42F変異体の結晶化条件では、結晶化剤の影響により458nmのみのシングルピークになってしまい、その結晶構造は野生型PYP様の構造になることが知られている。そこで本研究では新たにY42F変異体が380nmのショルダーを保ったまま結晶化できる結晶化条件のスクリーニング、及びその条件の最適化を行った。その結果、中性子結晶構造解析が可能だと考えられる大きさ3.1x0.7x0.7mm^3の結晶が得られた。来年度、この結晶を用いて中性子回折実験を行う予定である。