中性子と高分解能X線結晶構造解析によるタンパク質の水素原子を介した相互作用の解明

使用中子和高分辨率 X 射线晶体学阐明蛋白质氢原子介导的相互作用

• 批准号: 08J09586
• 负责人: 山口 繁生
• 金额: $ 0.77万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08J09586/
• 关键词: 低障壁水素結合; タンパク質中性子結晶構造解析; タンパク質X線結晶構造解析; Photoactive Yellow Protein; 光生物; 蛋白質中性子結晶構造解析; 蛋白質X線結晶構造解析; 光受容蛋白質

本研究では光受容タンパク質Photoactive Yellow Protein(PYP)をモデルタンパク質として、中性子結晶構造をもとに機能発現機構における水素原子の役割を明らかにすることを目的としている。昨年度の研究においては、野生型PYPの発色団(pCA)-E46間に形成された低障壁水素結合を観測し、タンパク質における低障壁水素結合の形成を初めて実証した(Yamaguchi S. et al. 2009, PNAS)。本年度の研究では、低障壁水素結合形成部位、及びその周辺に変異を加えたE46Q,Y42F変異体の中性子回折実験用結晶の調製、及び中性子結晶構造解析を行った。E46Q:PYPの結晶化に関する相図をもとに結晶化条件のスクリーニングを行い、最適な結晶化条件を得た。その結果5.1x1.2x0.7mm^3の結晶が得られ、この結晶を用いて日本原子力研究開発機構において中性子回折実験を行った。露光時間4時間で221枚の回折パターンを測定した。このデータセットは分解能1.5Åで処理することができた。中性子回折実験後、同じ結晶を用いてPFにおいて室温のX線回折実験を行い、分解能1.30Åのデータセットを得た。得られた中性子/X線両方のデータを併用して構造解析を行った結果、分解能1.5Å、信頼度因子R/Rfree=19.6%/21.8%で水素原子を含む立体構造を構築した。Y42F:これまでの研究よりY42F変異体では、吸収極大波長が446nmから458nmまで長波長シフトした上、380nmにショルダーが観測されることがわかっている。このことから、Y42FにおいてはpCA-E46間の低障壁水素結合に、何らかの変化が生じていると考えられる。しかし、これまでに報告されているY42F変異体の結晶化条件では、結晶化剤の影響により458nmのみのシングルピークになってしまい、その結晶構造は野生型PYP様の構造になることが知られている。そこで本研究では新たにY42F変異体が380nmのショルダーを保ったまま結晶化できる結晶化条件のスクリーニング、及びその条件の最適化を行った。その結果、中性子結晶構造解析が可能だと考えられる大きさ3.1x0.7x0.7mm^3の結晶が得られた。来年度、この結晶を用いて中性子回折実験を行う予定である。

This study is based on the photoacceptance material Photoactive Yellow Protein(PYP)をモデルタンパク性として, neutral son crystal structure The function of the mechanism is to reduce the water content of the hydrogen atom. Last year's research showed that low-barrier hydrogen was formed between wild-type PYP's pCA-E46 Combined を観measurement し、タンパク性におけるLow barrier water hydration combined のformation をInitial めて実证した(Yamaguchi S. et al. 2009, PNAS). This year's research focuses on the formation of low-barrier hydrogen bonds, the preparation of neutral-return crystals of E46Q and Y42F isomers, and the analysis of the neutral-neutral crystal structure. E46Q: The optimal crystallization conditions of PYP are determined by the corresponding crystallization conditions and the optimal crystallization conditions are obtained. The results of the 5.1x1.2x0.7mm^3 crystal are obtained, and the crystal is used by the Japan Atomic Force Research Institute and the neutral son is reversed. Exposure time 4 time, 221 pieces of the folded back and back measurement method. The このデータセットは decomposition can handle することができた at 1.5Å. After the neutral son was folded back and crystallized, the decomposition energy was obtained by using the X-ray X-ray at room temperature of 1.30Å のデータットを. Obtained the results of the られたneutron / Y42F: Research on Y42F heterogeneous body, absorption maximum wavelength 446nm 458 nm long wavelength wavelength, 380nm wavelength measurement, wavelength measurement.このことから, Y42F においてはpCA-E46 のlow barrier water binding に, らかの変化が生じていると卡えられる.しかし、これまでにreportされているY42F variant crystallization conditions では、Influence of crystallization 剤のにより458nmのみのシングルピークになってしまい, そのCrystal Structure は Wild-type PYP様のstructure になることが知られている.そこでThis research is based on the new Y42F variant 380nm のショルダーを宝ったままCrystallization and できるCrystallization conditionsのスクリーニング, and びそのconditionsのoptimizationを行った. As a result, it is possible to analyze the structure of the neutral crystal. In the coming year, the crystallization of この will be reversed with the neutral son of いて, and the action of この will be decided by である.

项目成果

Direct observation of two distinct types of short hydrogen bond in Photoactive Yellow Protein

直接观察光活性黄色蛋白中两种不同类型的短氢键

• 发表时间: 2008
• 作者: 坂東祥匡;白旗崇;和田拓;柴田幸治;森健彦;武藤豪志;大川真由子;今久保達郎;S. Yamaguchi;山口繁生;山口繁生
• 通讯作者: 山口繁生

Low-barrier hydrogen bond in photoactive yellow protein

• DOI: 10.1073/pnas.0811882106
• 发表时间: 2009-01
• 期刊: Proceedings of the National Academy of Sciences
• 作者: S. Yamaguchi;H. Kamikubo;K. Kurihara;R. Kuroki;N. Niimura;N. Shimizu;Y. Yamazaki;M. Kataoka