新規生物防除法の確立を目指した牧草共生菌と近縁病原菌の感染機構の比較解析

1.ProAのEfESDCプロモーターへの結合性先に,牧草共生菌Epichloe festucaeにおいて宿主植物との共生確立に必須なZn(II)2Cys6タイプの転写制御因子をコードするEfPROAを同定した。さらに、EfPROA破壊株において、Aspergillus nidulansの有性生殖に必須なesdCの相同遺伝子EfESDCの転写レベルが顕著に低下し、EfESDCがPROAの下流遺伝子であると推定された。マルトース結合タンパク(MBP)とProAの融合タンパク(MBP-ProA)を大腸菌で発現し、精製した。ゲルシフトアッセイ法を用いて、MBP-ProAのEJESDCのプロモーター配列への結合活性を調査したところ、MBP-ProAが、EfESDC開始コドンから631bP上流の配列GCGCCGに結合することが明らかとなった。本年度は、MBP-ProAが、EfESDC開始コドンから1140bp上流の配列GGCGCにも結合することを明らかにし左。さらに、EfESDCのプロモーター制御下の緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現を調査し、GFPの高発現には、140bp上流の配列GGCGCが必須であることが明らかとなった。2.クロマチン免疫沈降(ChIP)法を用いたE.festucaeのProAに制御される遺伝子群の解析ProAとGFPとの融合タンパク(ProA-GFP)発現ベクターを構築し、E.festucae野生株に導入した。得られた形質転換体においてProA-GFPが核に局在していることをGFP蛍光の観察により確認した。転写因子をクロマチンに固定した形質転換体から免疫沈降によってProA-GFPとともに結合したDNA断片を抽出した。リアルタイムPCR法により、抽出したDNA断片中にEfESDCプロモーターを含む複数のプロモーター配列が高濃度で存在することが明らかとなった。

1.ProAのEfESDCプロモーターへの結合性先に,牧草共生菌Epichloe festucaeにおいて宿主植物との共生確立に必須なZn(II)2Cys6タイプの転写制御因子をコードするEfPROAを同定した。さらに、EfPROA破壊株において、Aspergillus nidulansの有性生殖に必須なesdCの相同遺伝子EfESDCの転写レベルが顕著に低下し、EfESDCがPROAの下流遺伝子であると推定された。マルトース結合タンパク(MBP)とProAの融合タンパク(MBP-ProA)を大腸菌で発現し、精製した。ゲルシフトアッセイ法を用いて、MBP-ProAのEJESDCのプロモーター配列への結合活性を調査したところ、MBP-ProAが、EfESDC開始コドンから631bP上流の配列GCGCCGに結合することが明らかとなった。本年度は、MBP-ProAが、EfESDC開始コドンから1140bp上流の配列GGCGCにも結合することを明らかにし左。さらに、EfESDCのプロモーター制御下の緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現を調査し、GFPの高発現には、140bp上流の配列GGCGCが必須であることが明らかとなった。2.クロマチン免疫沈降(ChIP)法を用いたE.festucaeのProAに制御される遺伝子群の解析ProAとGFPとの融合タンパク(ProA-GFP)発現ベクターを構築し、E.festucae野生株に導入した。得られた形質転換体においてProA-GFPが核に局在していることをGFP蛍光の観察により確認した。転写因子をクロマチンに固定した形質転換体から免疫沈降によってProA-GFPとともに結合したDNA断片を抽出した。リアルタイムPCR法により、抽出したDNA断片中にEfESDCプロモーターを含む複数のプロモーター配列が高濃度で存在することが明らかとなった。