受容体・伝達物質相互作用の1分子解析

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本研究では神経情報伝達に関わる化学受容体分子とリガンド分子の双方を蛍光標識し1分子レベルで可視化することにより結合・解離過程をイメージングし、チャネル電流も同時計測することにより相互作用過程を実時間で測定可能な実験系を構築することを目的とする。昨年度に引き続き、nAChRの光学的・電気的同時計測のための条件決めを行った。我々は同時計測のための装置として水平に作成した脂質2重膜にチャネルタンパクを含むベシクルを融合させる方法を開発しているが、この方法を用いればリガンドや阻害剤を膜のどちらからでも付加することが可能である。今までnAChRに関しては溶液交換が困難なガラスピペットを用いたtip-dip法でなければ活性が測定できないと報告されてきた。しかし今回、膜作成の脂質条件を検討すると共に、シビレエイから精製したnAChRチャネルを含んだベシクルを膜直上で添加し直後に吸引するなどの改良を加え、カルバコールで開口する単一チャネル活性を測定することが出来た。今後は非天然アミノ酸コードをいた任意位置の蛍光標識変異体を用いて、リガンドとの相互作用の1分子レベルでの可視化計測を行う。並行して受容体とリガンドとの相互作用を1分子レベルで検出する計測系の開発を行い、昨年までにチャネルと帯電性生体高分子との相互作用により生じる電流ゆらぎを計測し生体分子センサー系への応用を目指す基礎実験を行っている。本年はこの検出法の検体濃度依存性について検討を行い、阻害過程が添加したDNA濃度に対して直線性を持つことを明らかにした。これによりライセニンチャネルが生体分子センサーのナノポアとして応用可能であることが示された。また印加する膜電位の大きさによってチャネル電流の阻害確率が変化する現象が観察され、検体の電気的な性質や膜電位自体をモニターするための手法としての応用が期待される。これらの結果は昨年までの知見とともに現在論文投稿中である。今後の展開としては、我々のグループで開発中であるゲルを用いた簡便な脂質二重膜作製法と組み合わせることにより、さらに簡便で安定な高感度分子センサーシステムの開発を目指す。