細胞内(形質膜)温度と温度感受性TRPチャネル電流の同時測定システムの確立

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温度感受性TRPチャネルの活性化温度閾値は膜電流とパッチクランプされた細胞近傍の溶液温度の変化を同時計測することで決定されている。しかし熱刺激を与えた際の細胞内温度、さらにはTRPチャネルが発現する形質膜付近の温度が実際にどのように変化しているのかはわかっていない。本研究では、細胞に熱刺激を与え、その時の細胞内温度の変化と膜電流の同時計測をおこない、これまでに報告されている温度感受性TRPチャネルの活性化温度閾値との比較をおこなった。細胞内温度の計測には、1励起2蛍光型の蛍光温度プローブを用い、この蛍光温度プローブを細胞へ導入し、熱刺激を与えた前後のレシオ値を解析した。また、従来パッチクランプを行う際に使用される顕微鏡システムでは熱刺激を与えた際の蛍光画像の取得が困難であったため、新たに同時計測用のシステムを組む必要があった。そこで、顕微鏡としては共焦点顕微鏡を使用することにした。共焦点顕微鏡には赤外線レーザーが温度刺激装置として搭載されているため、温度刺激によるフォーカスのズレがほとんど起こらない。この同時計測システム上で、温度感受性TRPチャネルを強制発現させたHEK293細胞に蛍光温度プローブを導入して解析をおこなった。温度感受性TRPチャネルとして、まずrat TRPV1を用いて同時計測を試みた。HEK293細胞でのrat TRPV1の定常発現株を使用し、はじめにHEK293細胞へのプローブの導入条件の検討、画像取得条件の検討、赤外線レーザーに対する応答確認をおこない、条件検討の上、同時計測をおこなった。