ミオシンVの正確な歩幅決定プロセスのマイクロ秒追跡

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本年度の研究目標は「新しい暗視野顕微鏡法の時空間分解能の評価と改善」および「金粒子の固定法の確立」であった. 第1の目標に関しては, 我々は全反射照明を応用した新しい暗視野顕微鏡技術を確立しスペックルや干渉縞の問題を解決した. 結果, 40nmの金プローブでは100μ秒, 80nmでは10μ秒の時間分解能でオングストローム単位の空間分解能を実現した. 第2の目標に関しては, ミオシンVのモータードメイン(N末端)にハロタグを用いたビオチンラベル法を確立し, アビジン標識した金プローブを効率よく結合することが可能になった. これらを用いて歩幅決定プロセスのマイクロ秒追跡を行い, 以下が明らかになった.ミオシンVは80nmのステップを実現するために, まず50nm地点で16m秒だけ停留し±40nmの範囲をくまなく探索する. 停留地点から30nm先の最適位置を検出した後は, 300μ秒以内にステップ反応を終了する. 同様の方法論を用いて, ミオシンVIは2種類のフォワードステップをもつことが明らかになった. 80nmステップは50nm地点で停留し, 40nmステップは10nm地点で停留する. これはミオシンVIの軸足の向きが2種類存在することを意味し, 同時にバックステップを含む多彩な歩行様式メカニズムも明らかになった.