高濃度の蛍光ATPを用いた1分子ATP加水分解イメージング

使用高浓度荧光 ATP 进行单分子 ATP 水解成像

基本信息

  • 批准号:
    19042015
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 3.2万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
  • 财政年份:
    2007
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    2007 至 2008
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

全反射蛍光顕微鏡法により1分子観測することが可能となったが, 観察蛍光分子の濃度は50nM程に限られる。申請者が提案する「量子ドット(以下QD)と蛍光共鳴エネルギー移動(以下FRET)を組み合わせた1分子イメージング手法」は、観察蛍光分子の濃度を従来の200倍まで引き上げることが可能である。本手法はミオシンに標識したQD(ドナー)とCy3-ATP(アクセプター)間のFRETにより実証する. QDとヌクレオチドポケットの距離を可能な限り短縮するため, QDの粒子径とミオシンへの標識方法を検討した. まず12アミノ酸からなる短鎖ペプチドで表面処理したペプチドコートQDを作成した。短鎖ペプチドは, QDに配位結合するポリシステインと親水性アミノ酸からなり、結果として粒子径の小さな親水性QDが得られる. 次に、ミオシンVの270番目のリジンをシステインに置換した変異体(K270C)を作成した。K270Cのシステイン残基のチオール基とコートペプチドのアミノ末端を架橋することで、ペプチドコートQDとミオシンVの特異的近接結合を実現した。作成したQDミオシンVをカバーガラスに固定し、Cy3-ATPの加水分解を高濃度1分子イメージングしたところ, Cy3とQDの蛍光強度は逆相関を示し、ヌクレオチドの結合解離をFRETのクライテリアで検出できた。ヌクレオチドの解離速度は, ミオシンVのMg ATPase rate(0.02〜0.03 S-1)に一致した. また, 試行錯誤の過程でCaATPase(0.07s^<-1>)がMg ATPaseの約3倍速いことが明らかになったため, Ca存在下での高濃度1分子イメージングを行ったところ, 期待通りの速い解離速度が検出できた.
The total reflection fluorescence microscopy method is used to detect the concentration of one molecule within the range of 50nM. The applicant proposed "Quantum resonance (QD) and fluorescence resonance (FRET) for molecular synthesis" and "200-fold increase in the concentration of fluorescence molecules." This method is based on the FRET between QD(D) and Cy3-ATP(A). QD particle diameter and identification method are discussed. The surface treatment of the 12-year-old short-lock is made up of the following materials: The short chain chain QDs are coordinated to the hydrophilic QDs, resulting in small particle sizes and hydrophilic QDs. The next step is to create a new variant (K270C) for the 270-point conversion process. The specific proximity binding of the K270 protein residues was realized by bridging the terminal regions of the protein. In this paper, we make a study on the relationship between the intensity of Cy3-ATP and the fluorescence intensity of QD, and the relationship between the intensity of Cy3-ATP and the fluorescence of FRET. Dissociation rate of Mg ATPase was consistent with Mg ATPase rate(0.02 ~ 0.03 S-1). CaATPase(0.07s^ ) was tested in the wrong process, <-1>and Mg ATPase was dissociated at about 3 times the speed of Ca in the presence of Ca.

项目成果

期刊论文数量(12)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
連続運動中の双頭ミオシン5のメカノケミカルカップリングの同時観察
双头肌球蛋白5连续运动过程中机械化学耦合的同时观察
  • DOI:
  • 发表时间:
    2007
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    城地 保昌;北尾 彰朗;西川 宗;須河 光弘
  • 通讯作者:
    須河 光弘
ナノ歩行モーターの1分子計測
纳米行走马达的单分子测量
  • DOI:
  • 发表时间:
    2008
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    西川宗;他
  • 通讯作者:
Single molecule FRET imaging of enzymatic reactions at high concentrations of fluorescently labeled ligands.
高浓度荧光标记配体下酶促反应的单分子 FRET 成像。
  • DOI:
  • 发表时间:
    2007
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    M. Sugawa;et. al.
  • 通讯作者:
    et. al.
Simultaneous observation of individual mechanochemical events of myosin V during processive 37nm steps
在持续 37 nm 步长过程中同时观察肌球蛋白 V 的各个机械化学事件
  • DOI:
  • 发表时间:
    2008
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    伊達朋子;他6名、脇田隆字;Mitsuhiro Sugawa
  • 通讯作者:
    Mitsuhiro Sugawa
高濃度の蛍光ATPを用いた1分子ATP加水分解イメージング
使用高浓度荧光 ATP 进行单分子 ATP 水解成像
  • DOI:
  • 发表时间:
    2008
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    Suzuki Y;Noma A;Suzuki T;Is hitani R;Nureki O.;西川宗
  • 通讯作者:
    西川宗
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    城地 保昌;北尾 彰朗;西川 宗;須河 光弘;中村努;Nishi M;Saitoh T
  • 通讯作者:
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  • 发表时间:
    2008
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  • 作者:
    城地 保昌;北尾 彰朗;西川 宗;須河 光弘;中村努;Nishi M;Saitoh T;Masaoka T;Takahashi Y
  • 通讯作者:
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