膵臓導管細胞に機能発現する内向き整流性KチャネルのKイオン依存性活性化機構

胰腺导管细胞中功能表达的内向整流钾离子通道的钾离子依赖性激活机制

• 批准号: 20790181
• 负责人: 林 美樹夫
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Kansai Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-20790181/
• 关键词: 膵臓; 導管細胞; 内向き整流性Kチャネル; Kイオン; パッチクランプ法; 免疫組織化学法

膵臓導管細胞に機能発現する内向き整流性Kチャネル(Kir2.0)の分子基盤および細胞外Kイオン依存性活性化機構を明らかにするため、導管細胞におけるKir2.0蛋白の分布を調べるとともに、チャネル機能に影響する抗体の作製を試みた。ラットから膵臓導管を遊離し、抗cytokeratin20および抗CFTRモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学法により導管細胞を同定した。そして、介在部導管または小葉内導管細胞にKir2.1、Kir2.2、およびKir2.4蛋白の発現を認めた。また、Kir2.1蛋白の細胞外領域に位置するアミノ酸配列(CVTDECPIA)を抗原とする抗Kir2.1ポリクローナル抗体を作製した。そしてKir2.1を強制発現させたHEK293細胞から蛋白を抽出し、ウェスタンブロッティング法で抗体の特異性を確認した。さらに免疫組織化学法により、Kir2.1強制発現細胞におけるKir2.1蛋白の細胞膜への局在性を認めた。しかし、パッチクランプ法によるホールセル電流測定において、この抗体はKir2.1電流を遮断できなかった。以上の結果から、Kir2.0蛋白がホモまたはヘテロでチャネルを構成し膵臓導管細胞に機能発現している可能性が示唆された。また、Kir2.1蛋白の細胞外領域に位置するアミノ酸残基がチャネル活性化に関与する証拠は抗Kir2.1ポリクローナル抗体を用いた機能解析からは得られなかった。今後は、この抗体を断片化したFabを用いた機能解析が期待される。

In order to understand the molecular basis of the inwardly rectifying Kir2.0 protein and the extracellular KIN-dependent activation mechanism that underlies functional development in ductal cells, to modulate the distribution of Kir2.0 protein in ductal cells, and to explore the production of antibodies that affect ductal function. Anti-cytokeratin 20 and anti-CFTR antibodies were used to identify the ductal cells. Kir2.1, Kir2.2, Kir2.4 proteins were identified in intralobular duct cells. The extracellular domain of Kir2.1 protein is located in the region of CVTDECPIA, and anti-Kir2.1 protein antibodies are produced. Kir2.1 was used to detect HEK293 cells and confirm the specificity of the antibody. Immunohistochemical method was used to identify Kir2.1 protein and its local expression in cell membrane. Kir2.1 Current measurement by Kir2.1 current detection method These results indicate the possibility that Kir2.0 protein may be involved in the development of vascular function. Kir2.1 protein protein extracellular domain position, acid residues, activation, and evidence of anti-Kir2.1 protein antibody use in functional analysis In the future, we expect to analyze the function of Fab fragments.