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細胞透過性ペプチドを応用した新規幹細胞創薬の開発

使用细胞穿透肽开发新的干细胞药物

基本信息

批准号：
20658026
负责人：
日出間志寿
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

大腸菌発現システムを用いてPTDを付加したMyoD(PTD-Tat-MyoD)タンパク質を発現し精製する系を確立した。MyoDは骨格筋細胞分化に必須な転写因子で標的DNA配列であるE-boxに結合する。作製したPTD-Tat-MyoDタンパク質がintactと同様にE-boxに結合するかをゲルシフトアッセイにて検証した。その結果PTD-Tat-MyoDタンパク質はE-boxに結合し転写因子の性質を保持していることが示された。マウス胎児由来10T1/2細胞にPTD-Tat-MyoD、5-azaCRを添加し細胞の形態観察を行った。添加後11日目から一部の細胞で多核化したものが得られた。次にluciferase assayを行った。すなわち培養中の10T1/2細胞の培地中にPTD-Tat-MyoDを添加しPTD-Tat-MyoDの細胞膜透過性と転写活性化能を検証した。無添加の対照群と比較しPTD-Tat-MyoD添加群は有意に細胞膜透過性と転写活性化能を示した。生後5日目のマウスの大腿筋から採取した初代筋芽細胞に同様のPTD-Tat-MyoDによる分化誘導処理をおこなったところ、管状構造をとり鼓動する多核細胞が得られた。また,RT-PCRを行いMyoDおよび骨格筋分化マーカーの発現を確認した。骨格筋細胞特異的抗ミオシン抗体で細胞を染色し分化した多核細胞が骨格筋細胞であることを示した。MyoDはbHLH構造をもつ転写因子である。近年このbHLH構造自身が細胞膜透過性を示すという知見が発表されたため、PTD-TatがないMyoDを大腸菌発現システムで作成、精製を行った。また半減期を延ばす目的で、MyoDのアミノ酸配列の5番目と200番目のセリンをアラニンに変換したPTD-Tat-MyoDS5.200Aを大腸菌発現システムで作成、精製を行った。MyoDのシグナルを伝えるMyoGにPTD-Tatを付加したPTD-Tat-MyoGを大腸菌発現システムで作成、精製した。今後これらの有用性について確立したアッセイ法で評価する予定である。

E. coli production process using PTD to enhance MyoD(PTD-Tat-MyoD) production process to improve the quality of the system established MyoD is an E-box binding protein that is essential for cell differentiation. The PTD-Tat-MyoD system is composed of two parts: one part is composed of two parts: one part As a result, the properties of PTD-Tat-MyoD are preserved in the E-box. The embryo is derived from PTD-Tat-MyoD and 5-azaCR and is observed morphologically. After 11 days of addition, a part of the cells were polynucleated. The next step is to perform a luciferase assay. The study of PTD-Tat-MyoD in culture of 10T1/2 cells demonstrated the permeability and activation of PTD-Tat-MyoD. Comparison with the control group without the additive shows that the PTD-Tat-MyoD additive group has an intentional effect on cell membrane permeability and write activity. At the 5th day after birth, the differentiation induction treatment of PTD-Tat-MyoD in the first generation of muscle bud cells was carried out, and the differentiation of tubular structure was stimulated. RT-PCR was performed to confirm the development of MyoD and skeletal muscle differentiation. Bone marrow cell-specific antibodies were used to stain cells and differentiate into multinucleated cells. MyoD bHLH In recent years, the bHLH structure itself has been shown to be permeable to cell membranes, and PTD-Tat-MyoD has been prepared and refined. In order to delay the half-life, MyoD's amino acid sequence is changed from 5 to 200 parts, PTD-Tat-MyoDS5.200A is prepared and refined. MyoD and MyoG are the most important components in the development of E. coli. In the future, the usefulness of this method will be established.