アミノ酸アミドのダイナミックな光学分割による光学活性アミノ酸の合成

通过氨基酸酰胺的动态光学拆分合成光学活性氨基酸

• 批准号: 09F09110
• 负责人: 浅野 泰久
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Toyama Prefectural University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2009
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2009 至 2010
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09F09110/
• 关键词: アミノ酸アミドラセマーゼ; α-アミノ-ε-カプロラクタム; ショットガンクローニング; D-フェニルアラニンアミド

D-α-アミノ-ε-カプロラクタム(ACL)を含む培地を用いた集積培養により、アミノ酸アミドに対して高いラセミ化活性を示す微生物としてEnsifer adhaerensを単離した。このE.adhaerensが有するアミノ酸アミドラセマーゼ(AaaR)の酵素学的な諸性質の解明を目指し、AaaRの精製に取り組んだ。5種類の異なるカラムを用い段階的に精製を進めることにより、ACLに対し96.7U/mgでラセミ化活性を示すまでに比活性を向上させることはできたが、単一酵素として精製することは非常に困難であった。そこで、ショットガンクローニングによるDNAライブラリーの作製とそのシークエンス解析へと展開し、遺伝子工学的な手法によるAaaRの発現によりその諸性質を明らかにすることにした。Achromobacter obae由来のACLラセマーゼとOchrobactrum anthropi由来のAaaR、それぞれのアミノ酸配列を基にデザインした縮重プライマーを用いPCRを行い、増幅した各フラグメントをpT7Blue vectorに挿入E.coli JM109を形質転換し、その塩基配列の解析を進めた。その結果、E.adhaerens由来のAaaRは、部分配列ではあるものの、A.obae由来のACLラセマーゼと62%、O.anthropi由来のAaaRと45%の相同性を示すことがわかり、新しいAaaRを生産する微生物としてEnsife radhaerensが有望なことがわかった。

D-α-ε-α- E.adhaerens has been developed to explain the enzymatic properties of AaaR and to refine AaaR. 5 kinds of different enzymes are used in the middle stage of purification, such as ACL, 96.7U/mg, and so on. The development and analysis of DNA and its properties in genetic engineering are discussed in detail. Achromobacter obae origin ACL sequence analysis and Ochrobactrum anthropi origin AaaR, Achromobacter obae origin ACL sequence analysis and Ochrobactrum anthropi origin ACL sequence analysis and Ochromobacter obae origin ACL sequence analysis and Ochrobactrum anthropi origin Achromobacter obae origin ACL sequence analysis and Ochromobacter obae origin The results showed that E.adhaerens derived from AaaR, partially aligned with A.obae derived from ACL, 62%, O.anthropi derived from AaaR, 45% of the identity of the microorganism, Ensiradfe haerens is expected to produce AaaR.

项目成果

Enzymatic racemisation of amino acid amides : Screening, purification and characterization of racemase from Ensifer adhaerens

氨基酸酰胺的酶促外消旋化：来自 Ensifer adhaerens 的外消旋酶的筛选、纯化和表征

• 发表时间: 2009
• 作者: P. KAUL;M.OTSUKA;Y.ASANO
• 通讯作者: Y.ASANO