フェニルケトン尿症の新しいスクリーニング法の開発

(1)酵素の安定化:安定化剤としてグリセロースが優れている。SporosarcinaやB.badiusのフェニルアラニン脱水素酵素はB.sphaericusのそれより、比較的基質特異性が低く、フェニルアラニンの定量に向いている。(2)酵素的定量法の開発:グリシン-KCl-KOH緩衝液(pH10.4)100μmol、NAD+2.5μmol、ヒドラジン・1H_201%(v/v)、L-フェニルアラニン脱水素酵素(Sporosarcina ureaeあるいはBacillus badiusよりの均一精製酵素)0.6単位、及びL-フェニルアラニン0〜0.1μmolを含む1.0mlの反応液を25℃で10分間反応し、340nmにおける吸光度を読み取った。前記反応組成から、L-フェニルアラニン脱水素酵素を除いたものを対照とした。この結果より検量線を作成したところ直線が得られた。この検量線は、L-フェニルアラニンが1000%脱水素され、NADAが等量生成した事を示し、本酵素を用いる定量が可能であることを示している。(3)フェニルケトン尿症のマススクリーニング法の開発:フェナジンメトサルフェートを用いる比色法を検討した。(4)遺伝子のクローニングと一次構造の解明:Sporosarcinaの本酵素遺伝子をクローニングし、B.badiusについては塩基配列を解明した。

(1)酵素の安定化:安定化剤としてグリセロースが優れている。SporosarcinaやB.badiusのフェニルアラニン脱水素酵素はB.sphaericusのそれより、比較的基質特異性が低く、フェニルアラニンの定量に向いている。(2)酵素的定量法の開発:グリシン-KCl-KOH緩衝液(pH10.4)100μmol、NAD+2.5μmol、ヒドラジン・1H_201%(v/v)、L-フェニルアラニン脱水素酵素(Sporosarcina ureaeあるいはBacillus badiusよりの均一精製酵素)0.6単位、及びL-フェニルアラニン0〜0.1μmolを含む1.0mlの反応液を25℃で10分間反応し、340nmにおける吸光度を読み取った。前記反応組成から、L-フェニルアラニン脱水素酵素を除いたものを対照とした。この結果より検量線を作成したところ直線が得られた。この検量線は、L-フェニルアラニンが1000%脱水素され、NADAが等量生成した事を示し、本酵素を用いる定量が可能であることを示している。(3)フェニルケトン尿症のマススクリーニング法の開発:フェナジンメトサルフェートを用いる比色法を検討した。(4)遺伝子のクローニングと一次構造の解明:Sporosarcinaの本酵素遺伝子をクローニングし、B.badiusについては塩基配列を解明した。