神経細胞膜・特殊ラフト領域の動的構造と機能の解明 : 1分子追跡による研究

神経細胞の細胞膜上での特殊ラフト領域の形成機構、およびその機能の理解のため、ラフト分子であるGPIアンカー型タンパク質のプリオンタンパク質(PrP)とThy-1をターゲット分子とし、1分子蛍光観察実験を行っている。この2種類のタンパク質は、神経細胞膜上の主要なGPIアンカー型タンパク質であるにもかかわらず、その機能にはまだ不明な点が多い。細胞膜上でのPrPとThy-1の挙動を1分子レベルで調べるため、私は3種類のタグタンパク質(GFPタグ、ACPタグ、Haloタグ)を付加したPrP分子とThy-1分子(GFP-PrP、GFP-Thy-1、ACP-Thy-1、ACP-PrP、Halo-PrP、Halo-Thy-1)のDNAコンストラクトを作製し、これを初代培養神経細胞、および、チャイニーズハムスターの卵巣由来の株細胞(CHO-K1)にそれぞれトランスフェクションして、1分子蛍光観察を行った。GFP、ACPまたはHaloを付加したPrP分子とThy-1分子の生細胞膜上での運動を、それぞれ統計的に解析したところ、2つの分子の拡散係数の違いは大きく、PrPはThy-1よりも1/2ほど小さい値を示した。さらに、CHO-K1細胞の細胞膜上のPrPは、拡散しては短時間の間、動きが鈍くなり、その後また動き出すという運動(一時停留)をThy-1よりも高頻度に行っている可能性があることがわかった。これら2つの分子の生細胞膜上での挙動の違いは、PrPとThy-1がそれぞれ細胞膜上に異なる特殊ラフト領域を形成していることを示唆しているのではないかと考えている。Roger Morrisらのグループによって、免疫電顕の観察から「PrPとThy-1はそれぞれ異なるドメインに存在する」と報告されている。これを生細胞で直接的に確かめるため、私は、同一細胞膜上のPrPとThy-1を同時に1分子観察する実験系を立ち上げた。具体的には、一方のタンパク質をGFPタグ、他方をACPタグフュージョンタンパク質とし、共トランスフェクションした同一の神経細胞中での2色同時1分子蛍光観察を行った。トランスフェクション効率の向上、1分子蛍光観察に適した発現レベルの調整といった課題があったが、実験条件を確定させ、1分子観察と解析を進めた。また、コントロールとして、我々の研究室の以前の研究から、すでに非ラフト分子であることが分かっている脂質分子(Cy3-DOPE)も合わせて観察、解析した。さらにPALM/STORM顕微鏡法という新たな手法を用いた実験にも着手している。この方法を用いると回折限界以上の数十nmという超解像度でのイメージングが可能になる。このPALM/STORM顕微鏡法を生きた神経細胞での観察に応用し、GPIアンカー型タンパク質が微小なドメインを形成している可能性を示唆する結果を得た。

神経細胞の細胞膜上での特殊ラフト領域の形成機構、およびその機能の理解のため、ラフト分子であるGPIアンカー型タンパク質のプリオンタンパク質(PrP)とThy-1をターゲット分子とし、1分子蛍光観察実験を行っている。この2種類のタンパク質は、神経細胞膜上の主要なGPIアンカー型タンパク質であるにもかかわらず、その機能にはまだ不明な点が多い。細胞膜上でのPrPとThy-1の挙動を1分子レベルで調べるため、私は3種類のタグタンパク質(GFPタグ、ACPタグ、Haloタグ)を付加したPrP分子とThy-1分子(GFP-PrP、GFP-Thy-1、ACP-Thy-1、ACP-PrP、Halo-PrP、Halo-Thy-1)のDNAコンストラクトを作製し、これを初代培養神経細胞、および、チャイニーズハムスターの卵巣由来の株細胞(CHO-K1)にそれぞれトランスフェクションして、1分子蛍光観察を行った。GFP、ACPまたはHaloを付加したPrP分子とThy-1分子の生細胞膜上での運動を、それぞれ統計的に解析したところ、2つの分子の拡散係数の違いは大きく、PrPはThy-1よりも1/2ほど小さい値を示した。さらに、CHO-K1細胞の細胞膜上のPrPは、拡散しては短時間の間、動きが鈍くなり、その後また動き出すという運動(一時停留)をThy-1よりも高頻度に行っている可能性があることがわかった。これら2つの分子の生細胞膜上での挙動の違いは、PrPとThy-1がそれぞれ細胞膜上に異なる特殊ラフト領域を形成していることを示唆しているのではないかと考えている。Roger Morrisらのグループによって、免疫電顕の観察から「PrPとThy-1はそれぞれ異なるドメインに存在する」と報告されている。これを生細胞で直接的に確かめるため、私は、同一細胞膜上のPrPとThy-1を同時に1分子観察する実験系を立ち上げた。具体的には、一方のタンパク質をGFPタグ、他方をACPタグフュージョンタンパク質とし、共トランスフェクションした同一の神経細胞中での2色同時1分子蛍光観察を行った。トランスフェクション効率の向上、1分子蛍光観察に適した発現レベルの調整といった課題があったが、実験条件を確定させ、1分子観察と解析を進めた。また、コントロールとして、我々の研究室の以前の研究から、すでに非ラフト分子であることが分かっている脂質分子(Cy3-DOPE)も合わせて観察、解析した。さらにPALM/STORM顕微鏡法という新たな手法を用いた実験にも着手している。この方法を用いると回折限界以上の数十nmという超解像度でのイメージングが可能になる。このPALM/STORM顕微鏡法を生きた神経細胞での観察に応用し、GPIアンカー型タンパク質が微小なドメインを形成している可能性を示唆する結果を得た。