RNAi機構を介したヘテロクロマチン構造形成における分裂酵母Chp1の新規機能の解析

裂殖酵母Chp1在RNAi机制介导的异染色质结构形成中的新功能分析

• 批准号: 09J07753
• 负责人: 石田 真由美
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kwansei Gakuin University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2009
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2009 至 2011
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09J07753/
• 关键词: 転写制御; ヘテロクロマチン; RNAi; RNAI

本研究は、分裂酵母のRNAi機構を介したヘテロクロマチン形成で中心的役割を果たす因子であるChp1のクロモドメイン(Chp1-CD)がメチル化ピストン(H3K9me)とRNAの両方を認識するという発見に基づき、その認識機構の詳細を明らかにすることを目的に以下の3つの課題を遂行した。1.RNA結合能を欠損する変異型Chp1-CDのH3K9me認識能の定量的測定:昨年度に引き続き、Chp1-CDのRNA結合に関与する3つのアミノ酸残基の変異が、Chp1-CDのH3K9me認識能に与える影響を調べるため、超高感度等温滴定型カロリメータ測定を行い、結合定数を算出した。その結果、RNA結合欠損型Chp1-CDのH3K9me認識能が野生型とほぼ同程度に保持されていることが確認された。2.Chp1-CDのRNA認識能とH3K9me認識の相互関連の解析:昨年度までに示唆されていた、Chp1-CDのRNA結合能とH3K9me認識能の相乗的な関係について、EMSAによる滴定実験を行い、その結合定数を算出した。その結果、Chp1-CDのRNA結合がH3K9me添加により約10倍強くなったことから、Chp1-CDはH3K9me結合時には単体時とは異なる様式でRNAと結合することが示唆された。NMR解析の結果、RNA添加によってC-末端のα-ヘリックス領域の化学シフトが確認されたため、変異解析から、実際にこの領域がH3K9me結合時のChp1-CDのRNA結合に関与することを確認した。3.ヘテロクロマチン構造形成におけるChp1-CDのRNA結合能の意義の解析:RNAi機構を介したヘテロクロマチン構造形成におけるChp1-CDのRNA結合能の重要性を調べるため、RNA結合能を欠損させた変異Chp1を発現させ、ヘテロクロマチンタンパク質Swi6とH3K9meの局在、小分子RNAの産生、RITS複合体形成への影響を調べた。その結果、Chp1-CDのRNA結合能はRITS複合体形成には大きな影響を持たないが、Chp1のサイレンシング機能に必須であることが明らかになった。

This research is based on the following three topics: to understand the role of Chp1's cookie device (Chp1-CD) in the formation of the central RNAi mechanism in splitting yeast, to establish the basis for understanding the mechanism of RNA (H3K9me), and to clarify the details of the understanding mechanism. 1. Quantitative determination of RNA binding energy of Chp1-CD and H3K9me: last year, the relationship between RNA binding energy of Chp1-CD and H3K9me binding energy of Chp1-CD was analyzed. As a result, the recognition ability of RNA binding deficient Chp1-CD and H3K9me was maintained to the same extent as that of wild type. 2. Analysis of the correlation between Chp1-CD RNA recognition energy and H3K9me recognition: The correlation between Chp1-CD RNA recognition energy and H3K9me recognition energy was analyzed in the past year, and the correlation between Chp1-CD RNA binding energy and H3K9me recognition energy was calculated. As a result, Chp1-CD RNA binding to H3K9me is about 10-fold stronger than that of Chp1-CD RNA binding to H3K9me. The results of NMR analysis, RNA addition and α-terminal binding of Chp1-CD were confirmed. 3. Analysis of the significance of Chp1-CD RNA binding energy in the formation of RNA structure: The importance of RNA binding energy of Chp1-CD in the formation of RNA structure was modulated. The effect of RNA binding energy deficiency on the development of Chp1, the development of small molecule RNA and the formation of RITS complex was modulated. As a result, Chp1-CD RNA binding activity has a significant impact on the formation of RITS complexes, and Chp1 RNA binding activity is essential for the formation of RITS complexes.

项目成果

HP1/Swi6 Acts in Concert with Ers1 to Regulate RNAi-directed Heterochromatin Assembly

HP1/Swi6 与 Ers1 协同调节 RNAi 指导的异染色质组装

• 发表时间: 2012
• 作者: 3.Ishida M;Shimojo H;Hayashi A;Kawaguchi R;Ohtani Y;Uegaki K;Nishimura Y;Nakayama J.;Kei Kawakami;林 亜紀;林 亜紀;Aki Hayashi
• 通讯作者: Aki Hayashi

ヘテロクロマチン構造形成における分裂酵母Chp1の機能解析

裂殖酵母Chp1在异染色质结构形成中的功能分析

• 发表时间: 2011
• 作者: Ishida M.;Hayashi A.;石田真由美
• 通讯作者: 石田真由美

Intrinsic Nucleic Acid-Binding Activity of Chp1 Chromodomain Is Required for Heterochromatic Gene Silencing

• DOI: 10.1016/j.molcel.2012.05.017
• 发表时间: 2012-07-27
• 期刊: MOLECULAR CELL
• 影响因子: 16
• 作者: Ishida, Mayumi;Shimojo, Hideaki;Nakayama, Jun-ichi
• 通讯作者: Nakayama, Jun-ichi