RNAi機構を介したヘテロクロマチン構造形成における分裂酵母Chp1の新規機能の解析

裂殖酵母Chp1在RNAi机制介导的异染色质结构形成中的新功能分析

• 批准号: 09J07753
• 负责人: 石田 真由美
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kwansei Gakuin University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2009
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2009 至 2011
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09J07753/
• 关键词: 転写制御; ヘテロクロマチン; RNAi; RNAI

本研究は、分裂酵母のRNAi機構を介したヘテロクロマチン形成で中心的役割を果たす因子であるChp1のクロモドメイン(Chp1-CD)がメチル化ピストン(H3K9me)とRNAの両方を認識するという発見に基づき、その認識機構の詳細を明らかにすることを目的に以下の3つの課題を遂行した。1.RNA結合能を欠損する変異型Chp1-CDのH3K9me認識能の定量的測定:昨年度に引き続き、Chp1-CDのRNA結合に関与する3つのアミノ酸残基の変異が、Chp1-CDのH3K9me認識能に与える影響を調べるため、超高感度等温滴定型カロリメータ測定を行い、結合定数を算出した。その結果、RNA結合欠損型Chp1-CDのH3K9me認識能が野生型とほぼ同程度に保持されていることが確認された。2.Chp1-CDのRNA認識能とH3K9me認識の相互関連の解析:昨年度までに示唆されていた、Chp1-CDのRNA結合能とH3K9me認識能の相乗的な関係について、EMSAによる滴定実験を行い、その結合定数を算出した。その結果、Chp1-CDのRNA結合がH3K9me添加により約10倍強くなったことから、Chp1-CDはH3K9me結合時には単体時とは異なる様式でRNAと結合することが示唆された。NMR解析の結果、RNA添加によってC-末端のα-ヘリックス領域の化学シフトが確認されたため、変異解析から、実際にこの領域がH3K9me結合時のChp1-CDのRNA結合に関与することを確認した。3.ヘテロクロマチン構造形成におけるChp1-CDのRNA結合能の意義の解析:RNAi機構を介したヘテロクロマチン構造形成におけるChp1-CDのRNA結合能の重要性を調べるため、RNA結合能を欠損させた変異Chp1を発現させ、ヘテロクロマチンタンパク質Swi6とH3K9meの局在、小分子RNAの産生、RITS複合体形成への影響を調べた。その結果、Chp1-CDのRNA結合能はRITS複合体形成には大きな影響を持たないが、Chp1のサイレンシング機能に必須であることが明らかになった。

这项研究基于发现，CHP1（CD）的染色体构系（这是通过裂变酵母RNAi机制在异染色质形成中起着核心作用的因素，识别甲基化活塞（H3K9ME）和RNA，并且我们执行了以下三个任务，以阐明其认可机制的详细信息，以实现以下三个任务。 1。缺乏RNA结合能力的突变体CHP1-CD中H3K9ME识别能力的定量测量：在去年之后，为了研究参与RNA结合的三种氨基酸残基对H3K9ME结合对H3K9ME识别能力的突变的影响，Ultra敏感性等体等分等异光效应滴定效应量的粘结量均表现出了表演的均衡量。结果，已经证实，RNA结合缺陷的CHP1-CD识别H3K9ME的能力与野生型的能力保持在相同的程度上。 2。分析CHP1-CD和H3K9ME识别的RNA识别能力之间的关系：使用EMSA进行了滴定实验，以计算CHP1-CD和H3K9ME识别能力之间的RNA结合能力之间的协同关系，直到去年建议，它一直建议使用，并计算了结合常数。结果，CHP1-CD的RNA结合与H3K9ME添加的强度约为10倍，这表明CHP1-CD以与单独绑定到H3K9ME时的方式不同。 NMR分析的结果是，通过添加RNA证实了C-末端的α-螺旋区域的化学位移，突变分析证实该区域实际上在H3K9ME结合时CHP1-CD的RNA结合起着作用。 3. Analysis of the significance of RNA-binding ability of Chp1-CD in heterochromatin structure formation: To investigate the importance of RNA-binding ability of Chp1-CD in heterochromatin structure formation via the RNAi mechanism, we expressed mutant Chp1, which lacked RNA-binding ability, and investigated the localization of heterochromatin proteins Swi6 and H3K9me, the production of small分子RNA，以及对RITS复合物形成的影响。结果表明，CHP1-CD的RNA结合能力对RITS复合形成没有显着影响，但对于CHP1的沉默函数至关重要。

项目成果

HP1/Swi6 Acts in Concert with Ers1 to Regulate RNAi-directed Heterochromatin Assembly

HP1/Swi6 与 Ers1 协同调节 RNAi 指导的异染色质组装

• 发表时间: 2012
• 作者: 3.Ishida M;Shimojo H;Hayashi A;Kawaguchi R;Ohtani Y;Uegaki K;Nishimura Y;Nakayama J.;Kei Kawakami;林 亜紀;林 亜紀;Aki Hayashi
• 通讯作者: Aki Hayashi

Intrinsic Nucleic Acid-Binding Activity of Chp1 Chromodomain Is Required for Heterochromatic Gene Silencing

• DOI: 10.1016/j.molcel.2012.05.017
• 发表时间: 2012-07-27
• 期刊: MOLECULAR CELL
• 影响因子: 16
• 作者: Ishida, Mayumi;Shimojo, Hideaki;Nakayama, Jun-ichi
• 通讯作者: Nakayama, Jun-ichi

ヘテロクロマチン構造形成における分裂酵母Chp1の機能解析

裂殖酵母Chp1在异染色质结构形成中的功能分析

• 发表时间: 2011
• 作者: Ishida M.;Hayashi A.;石田真由美
• 通讯作者: 石田真由美