魚類の浸透圧調節としてのカルシウムケーキ形成機構の解明

高浸透圧環境下で棲息する海水魚は体液と海水の間に生じる浸透圧差により、体内の水分が失われ、過剰なイオンが流入する。海水魚は恒常性を維持するため海水を飲み、水を吸収する。海水に含まれる過剰なイオンを除去することは重要である。Ca,Mg等の2価イオンは腸内でイオン化しているCa,Mgを沈殿させ炭酸塩(カルシウムケーキ)を形成させ腸内から除去する。Ca,Mgと反応する重炭酸イオン(HCO_3^-)は沈殿形成に重要であるが、その分泌機構は不明である。そこで本研究ではHCO_3^-の分泌機構を明らかしようと試みた。昨年度はHCO_3^-分泌器官が腸及び膵臓であることが同定され、遺伝子学的手法を用いて網羅的にHCO_3^-輸送体を解析したところ膵臓ではSlc26a1,Slc26a6A、腸ではSlc26a1,Slc26a3が沈殿形成に関わる輸送体であると示唆された。本年度はHCO_3^-の分泌機構解明のため更に詳細な解析を試みた。昨年度同定した輸送体の存在位置を確認するために免疫組織化学的染色を行った。その結果Slc26a1,Slc26a6Aは上皮組織の頂端膜側に強い免疫反応を呈した。次に同定したHCO_3^-輸送体の機能解析を試みた。膵臓の膵管を単離し、膵管内にpH蛍光指示薬を挿入してHCO_3^-の分泌を可視化した。膵管培養液中にHCO_3^-を添加するとHCO_3^-は膵管内のpHが上昇し、HCO_3^-輸送体の阻害剤を用いるとpHは上昇しなかった。また、導管細胞内でのHCO_3^-産生を確認するためHCO_3^-産生に関わる酵素(CA)の活性を測定した。淡水、海水馴致個体で比較したところ、活性は低く有意な差は見られなかった。さらに導管細胞にHCO_3^-を取込む基底膜側のHCO_3^-輸送体(Na,HCO_3^-共輸送体:NBC)の免疫組織化学的染色を行ったところ導管細胞の基底膜側に免疫反応を呈したが、淡水、海水馴致個体で発現に差は見られなかった。これらの結果より、HCO_3^-は膵管の導管細胞で産生されるのではなく、血液など膵管外部を満たす体液のHCO_3^-を導管細胞が基底膜側から細胞内へNBCを介して取込み、逆側の頂端膜側から膵管内へSlc26a1,Slc26a6Aを介して分泌するというメカニズムが示唆された。

高浸透圧環境下で棲息する海水魚は体液と海水の間に生じる浸透圧差により、体内の水分が失われ、過剰なイオンが流入する。海水魚は恒常性を維持するため海水を飲み、水を吸収する。海水に含まれる過剰なイオンを除去することは重要である。Ca,Mg等の2価イオンは腸内でイオン化しているCa,Mgを沈殿させ炭酸塩(カルシウムケーキ)を形成させ腸内から除去する。Ca,Mgと反応する重炭酸イオン(HCO_3^-)は沈殿形成に重要であるが、その分泌機構は不明である。そこで本研究ではHCO_3^-の分泌機構を明らかしようと試みた。昨年度はHCO_3^-分泌器官が腸及び膵臓であることが同定され、遺伝子学的手法を用いて網羅的にHCO_3^-輸送体を解析したところ膵臓ではSlc26a1,Slc26a6A、腸ではSlc26a1,Slc26a3が沈殿形成に関わる輸送体であると示唆された。本年度はHCO_3^-の分泌機構解明のため更に詳細な解析を試みた。昨年度同定した輸送体の存在位置を確認するために免疫組織化学的染色を行った。その結果Slc26a1,Slc26a6Aは上皮組織の頂端膜側に強い免疫反応を呈した。次に同定したHCO_3^-輸送体の機能解析を試みた。膵臓の膵管を単離し、膵管内にpH蛍光指示薬を挿入してHCO_3^-の分泌を可視化した。膵管培養液中にHCO_3^-を添加するとHCO_3^-は膵管内のpHが上昇し、HCO_3^-輸送体の阻害剤を用いるとpHは上昇しなかった。また、導管細胞内でのHCO_3^-産生を確認するためHCO_3^-産生に関わる酵素(CA)の活性を測定した。淡水、海水馴致個体で比較したところ、活性は低く有意な差は見られなかった。さらに導管細胞にHCO_3^-を取込む基底膜側のHCO_3^-輸送体(Na,HCO_3^-共輸送体:NBC)の免疫組織化学的染色を行ったところ導管細胞の基底膜側に免疫反応を呈したが、淡水、海水馴致個体で発現に差は見られなかった。これらの結果より、HCO_3^-は膵管の導管細胞で産生されるのではなく、血液など膵管外部を満たす体液のHCO_3^-を導管細胞が基底膜側から細胞内へNBCを介して取込み、逆側の頂端膜側から膵管内へSlc26a1,Slc26a6Aを介して分泌するというメカニズムが示唆された。