糖鎖プロファイリングに貢献する機能強化組み換えレクチンの開発

开发有助于聚糖分析的功能增强重组凝集素

基本信息

批准号：
10F00218
负责人：
平林淳
金额：
$ 1.22万
依托单位：
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2011
项目状态：
已结题

项目摘要

レクチンアレイは細胞固有の複雑な糖鎖構造を迅速簡便に評価する「糖鎖プロファイリング」のためのツールとして注目され、現在その応用展開が活発に行われている。しかし、従来アレイに供されているレクチンの多くは天然物由来のもので、このため複雑多様な糖鎖構造(グライコーム)を網羅することが困難とされる。本研究では、レクチンレパートリーの拡充、結合親和性や特異性の改善を目指し、分子進化工学的な手法と糖鎖工学技術を駆使した改変レクチンの開発を行うことで、糖鎖機能の解明や実用化に貢献できるレクチンプローブを提供することを目的とした。昨年度、モデル系としてR型レクチン(リシンB鎖超家系)に属する29kDaミミズ由来ガラクトース結合性レクチン(EW29)のC末端側ドメイン(約14kDa)を親タンパク質とし、エラー導入PCR・リボソームディスプレイ法(分子進化工学)に糖鎖複合体アレイ(糖鎖工学)を用いたスクリーニング系を導入することでハイスループットな進化工学系をほぼ構築した。今回、強化された本システムを用い、今まで優れた検出プローブの無い硫酸化糖鎖に対する特異的な改変レクチンの創出に挑んだ。糖鎖複合体アレイを用いた迅速スクリーニング系によって6-硫酸化ラクトサミン(6SLN)ポリマーに対し新たに結合力を獲得した20クローンを選別した。配列解析の結果、14クローンに共通して特定の変異(Glu20Lys)導入が確認された。これらのクローンはいずれも6SLNに特性を示すことが判明し、さらにこの一箇所の点突然変異のみで6SLNへの親和性を獲得していることが示された。さらに本改変レクチンの有用性を組織染色やフロサイトメトリ解析で実証した。

凝集素阵列吸引了作为“聚糖分析”的工具的注意力，该工具可以快速，轻松地评估细胞独有的复杂聚糖结构，目前正在其应用中积极开发。但是，阵列中使用的大多数凝集素都是从天然产物中得出的，因此很难覆盖复杂而多样的聚糖结构（Glycomb）。这项研究旨在扩大凝集素库并改善结合亲和力和特异性，并提供凝集素探针，通过使用分子进化工程技术和糖基化工程技术开发改良的凝集素，从而有助于阐明聚糖功能和实际应用。去年，我们通过使用29 kDa earth源的eart虫衍生的半乳糖结合凝集素（EW29）的C末端域（约14 kDa）建立了高通量进化工程系统，该eR源是r-type lectin（lysin b-chain suppry in node a procenty syment a Mode a groply of a Model of a groply System and procens of gensys），并介绍阵列（糖细胞）进入误差引入PCR和核糖体显示方法（分子进化工程）。这次，使用这种增强的系统，我们试图为没有出色的检测探针的硫酸糖链创建特定的修饰凝集素。使用糖基化复合物阵列的快速筛选系统选择了20个具有新获得的结合强度的克隆，这些克隆具有新获得的结合强度。序列分析证实，特定的突变（GLU20LYS）是在14个克隆中共有的。所有这些克隆都在6SLN中表现出表征，进一步表明单独的单点突变对6SLN具有亲和力。此外，通过组织染色和速效仪分析证明了这种修饰的凝集素的有用性。