高分解能X線結晶構造解析を用いた脱窒菌呼吸鎖における電子伝達機構の構造基盤研究

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本研究は銅型亜硝酸還元酵素(NIR)とその電子供与タンパク質であるシトクロムc_<551>(Cytc_<551>)との間の電子伝達機構を明らかにすることを目的としている.タンパク質間の電子伝達は,タンパク質が一過性の複合体を形成することで行われるが,複合体形成が短時間で起こるため,効率のよい電子移動反応のための構造的要因を原子レベルで明らかにすることは難しい.それゆえ,電子伝達複合体の立体構造の決定はタンパク質間電子移動反応を理解するのに大変有用である.本研究では,既に明らかになっているNIRとCytc_<551>の複合体状態でのX線結晶構造解析結果に基づき,研究を進めてきた.前年度においては,NIRのアミノ酸残基Met135をSerに置換した変異体M135Sを作製し,電子移動反応速度が約9分の1に低下することを確認し,さらに複合体のX線結晶構造解析から,複合体形成時の相互作用面における立体構造変化や原子環境の重要性を明らかにした.今年度は,さらにMet135をLeuとAlaに置換した変異体M135LおよびM135Aを作製し,電子移動反応速度の測定とX線結晶構造解析を行った.M135LとM135A変異体は天然型に比べて,Cytc_<551>との間の電子移動反応速度が4分の1と3分の1に低下した.M135AとCytc_<551>の共結晶化は今のところ成功していないが,M135LとCytc_<551>の複合体の共結晶化には成功し,X線結晶構造解析により,分解能1.05Åの原子分解能で立体構造を決定することができた.M135L:Cytc_<551>複合体ではCytc_<551>の会合様式が大きく異なっていた.今後水素を含めた詳細な立体構造解析に計算化学など複合的な手法を取り入れることで,過渡的なタンパク質複合体形成のメカニズムについての知見が明らかになっていくと考えられる.さらに,Cytc_<551>の立体構造はこれまで複合体状態でのみしか得られていなかったので,Cytc_<551>単独でのX線結晶構造解析を行い,分解能1.8Åで立体構造を決定した.単独状態と複合体状態の立体構造を比較することにより,Cytc_<551>においても,複合体形成に伴う立体構造変化が確認された.本研究により,NIR:Cytc_<551>電子伝達複合体形成時に生じる立体構造変化の詳細が明らかになり,タンパク質間電子移動反応のメカニズムを理解するための構造基盤を確立することができた.