蛍光を用いたPKCリガンドの2段階結合評価系の構築とバイオセンサーへの応用

蛍光を用いたPKCリガンドの2段階階評価系の構築とバイオセンサーへの応用を目的とし、蛍光標識したPKCリガンド結合ドメイン(C1b)を用いる評価系のリガンド結合検出感度の向上を試みた。蛍光性δC1bを基にした評価系では、リガンド結合に伴う環境応答性蛍光基近傍の環境変化に起因する蛍光強度の増大によりリガンドの結合を検出する。なので、リガンド結合ポケットと蛍光基の距離が検出感度に影響すると考えた。そこで、リガンド結合ポケットと蛍光基の距離の最適化を行うためのリンカー長を変えた新たな蛍光性δC1bの作製に用いる蛍光修飾されたアミノ酸誘導体の合成に着手した。これまで作成した蛍光性δC1bのリンカー長(1nm)を参考に、αCから0.3nm-1.5nm離れた側鎖部分に蛍光基を有する蛍光性Fmocアミノ酸を合成した。既存の蛍光性δC1bよりも短い0.6nmのリンカーを有する蛍光性δC1bを作成し、[^3H]PDBuを用いた競合阻害実験行ったところwild typeと同等の[^3H]PDBu結合活性を示した。また、競合阻害実験において実際にリガンドと結合している分子の割合をwildtypeを基準に算出したところ、既存の蛍光性δC1bは10%なのに対し0.6nmリンカーを有する蛍光性δC1bは48%であることから、リンカー長を短くしたことでリガンド結合能を有するフォールディング状態の安定性が向上したと考えられる。蛍光性δC1bの構造安定性は評価系の再現性に大きく影響するため、これらの結果は蛍光性δC1bを用いる評価系を実用化するうえで重要な知見である。

蛍光を用いたPKCリガンドの2段階階評価系の構築とバイオセンサーへの応用を目的とし、蛍光標識したPKCリガンド結合ドメイン(C1b)を用いる評価系のリガンド結合検出感度の向上を試みた。蛍光性δC1bを基にした評価系では、リガンド結合に伴う環境応答性蛍光基近傍の環境変化に起因する蛍光強度の増大によりリガンドの結合を検出する。なので、リガンド結合ポケットと蛍光基の距離が検出感度に影響すると考えた。そこで、リガンド結合ポケットと蛍光基の距離の最適化を行うためのリンカー長を変えた新たな蛍光性δC1bの作製に用いる蛍光修飾されたアミノ酸誘導体の合成に着手した。これまで作成した蛍光性δC1bのリンカー長(1nm)を参考に、αCから0.3nm-1.5nm離れた側鎖部分に蛍光基を有する蛍光性Fmocアミノ酸を合成した。既存の蛍光性δC1bよりも短い0.6nmのリンカーを有する蛍光性δC1bを作成し、[^3H]PDBuを用いた競合阻害実験行ったところwild typeと同等の[^3H]PDBu結合活性を示した。また、競合阻害実験において実際にリガンドと結合している分子の割合をwildtypeを基準に算出したところ、既存の蛍光性δC1bは10%なのに対し0.6nmリンカーを有する蛍光性δC1bは48%であることから、リンカー長を短くしたことでリガンド結合能を有するフォールディング状態の安定性が向上したと考えられる。蛍光性δC1bの構造安定性は評価系の再現性に大きく影響するため、これらの結果は蛍光性δC1bを用いる評価系を実用化するうえで重要な知見である。