内分泌細胞に富む消化管オルガノイドの開発と消化管ホルモンの分泌調節因子の解明

富含内分泌细胞的胃肠类器官的开发和胃肠激素分泌调节剂的阐明

• 批准号: 21K05941
• 负责人: 翁長 武紀
• 金额: $ 2.16万
• 依托单位: Rakuno Gakuen University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K05941/
• 关键词: Xenin; 内分泌細胞; オルガノイド; 胃オルガノイド; 小腸オルガノイド; 消化管ペプチド; 腸内分泌細胞; 刺激分泌連関; バイオセンサー

昨年度の報告書に記載した今後の方針に基づいて①胃および②十二指腸粘膜をコラゲナーゼ処理で分散した細胞塊と、③十二指腸粘膜をCa2+キレート法により分散した細胞塊をそれぞれ48穴プレート内のマトリゲルに播種し、Satoら(2018)の報告に基づいたDMEM/F12を基本液とする通常の増殖用培養液で培養した。基本的に胃の細胞培養にはGastrinとFGF-10を添加し、十二指腸の細胞培養にはIGF-IとFGF-2を添加した。増殖用培養液にはマウスrecombinant Wnt3a（mr-Wnt3A）を使用した系とAfamin-Wnt3aを使用した系の2系列を調製し、a.増殖用培養液のみ、b.ニコチンアミド添加、c.ニコチンアミドおよびRHOK-inhibitorであるY-27632の添加条件で培養した。しかし、いずれにおいてもオルガノイドの形成はみられなかったため、途中で培養液のmr-Wnt3a、Afamin-Wnt3aおよびR-spondinの濃度を修正して培養を続けた。さらに新規に細胞を分離して、上記の2系統の基本培養液に加えてY-27632や、p38 MAP kinase inhibitorであるSB202190、GSK inhibitorであるCHIR 99021の添加の有無による細胞増殖への効果も検討したが、いずれもオルガノイドの形成には至らなかった。そこで、上記の無血清培地ではなく、10%ウシ胎仔血清を含むDMEM/F12とL-WRN(Wnt, R-spondin, Noggin)調整培養液を混和したMiyoshiら(2013)の培養方法を基本として、上記の3因子の添加の有無を比較する方法でも同様に検討したが、やはり内分泌細胞に富むオルガノイドを誘導できなかった。培養実験は何れも複数回行ったが、目的とするようなオルガノイドの作製まで至っていない。

基于去年报告中描述的未来政策，1）胃和2）通过胶原酶治疗散布的十二指肠粘膜和3）3）通过Ca2+螯合方法分散的细胞量分散在48孔培养物中，并在正常的培养基中培养在Matrigel上，并使用培养基培养在正常的培养基中。 （2018）。基本上，将胃蛋白和FGF-10添加到胃细胞培养中，然后将IGF-I和FGF-2添加到十二指肠细胞培养中。为生长培养准备了两个系列：使用小鼠重组WNT3A（MR-WNT3A）的系统和使用Afamin-Wnt3a的系统，并在a的条件下进行培养。仅添加生长培养基b。添加烟酰胺，c。烟酰胺和Y-27632，它是Rhok抑制剂。但是，在任何一种情况下均未观察到类器官形成，因此在中间调整了培养基中MR-WNT3A，AFAMIN-WNT3A和R-SPONDIN的浓度，并继续培养。此外，还对细胞进行了新分离，添加Y-27632，SB202190，P38 MAP激酶抑制剂和GSK抑制剂Chir 99021的效果也被研究了细胞增殖，但它们均未导致这些形成。因此，基于Miyoshi等人的培养方法，同样研究了上述比较三个因素的存在或不存在的方法。 （2013年），将含有10％胎牛血清的DMEM/F12与L-WRN（Wnt，R-Spondin，Noggin）制备的培养基而不是上述无血清的培养基，但不能诱发上述富含富含内分泌细胞中富含类的类子体的类和细胞的添加方法的方法。尽管所有培养实验都是多次进行的，但没有实现预期的类器官的产生。