内分泌細胞に富む消化管オルガノイドの開発と消化管ホルモンの分泌調節因子の解明

昨年度の報告書に記載した今後の方針に基づいて①胃および②十二指腸粘膜をコラゲナーゼ処理で分散した細胞塊と、③十二指腸粘膜をCa2+キレート法により分散した細胞塊をそれぞれ48穴プレート内のマトリゲルに播種し、Satoら(2018)の報告に基づいたDMEM/F12を基本液とする通常の増殖用培養液で培養した。基本的に胃の細胞培養にはGastrinとFGF-10を添加し、十二指腸の細胞培養にはIGF-IとFGF-2を添加した。増殖用培養液にはマウスrecombinant Wnt3a（mr-Wnt3A）を使用した系とAfamin-Wnt3aを使用した系の2系列を調製し、a.増殖用培養液のみ、b.ニコチンアミド添加、c.ニコチンアミドおよびRHOK-inhibitorであるY-27632の添加条件で培養した。しかし、いずれにおいてもオルガノイドの形成はみられなかったため、途中で培養液のmr-Wnt3a、Afamin-Wnt3aおよびR-spondinの濃度を修正して培養を続けた。さらに新規に細胞を分離して、上記の2系統の基本培養液に加えてY-27632や、p38 MAP kinase inhibitorであるSB202190、GSK inhibitorであるCHIR 99021の添加の有無による細胞増殖への効果も検討したが、いずれもオルガノイドの形成には至らなかった。そこで、上記の無血清培地ではなく、10%ウシ胎仔血清を含むDMEM/F12とL-WRN(Wnt, R-spondin, Noggin)調整培養液を混和したMiyoshiら(2013)の培養方法を基本として、上記の3因子の添加の有無を比較する方法でも同様に検討したが、やはり内分泌細胞に富むオルガノイドを誘導できなかった。培養実験は何れも複数回行ったが、目的とするようなオルガノイドの作製まで至っていない。

昨年度の報告書に記載した今後の方針に基づいて①胃および②十二指腸粘膜をコラゲナーゼ処理で分散した細胞塊と、③十二指腸粘膜をCa2+キレート法により分散した細胞塊をそれぞれ48穴プレート内のマトリゲルに播種し、Satoら(2018)の報告に基づいたDMEM/F12を基本液とする通常の増殖用培養液で培養した。基本的に胃の細胞培養にはGastrinとFGF-10を添加し、十二指腸の細胞培養にはIGF-IとFGF-2を添加した。増殖用培養液にはマウスrecombinant Wnt3a（mr-Wnt3A）を使用した系とAfamin-Wnt3aを使用した系の2系列を調製し、a.増殖用培養液のみ、b.ニコチンアミド添加、c.ニコチンアミドおよびRHOK-inhibitorであるY-27632の添加条件で培養した。しかし、いずれにおいてもオルガノイドの形成はみられなかったため、途中で培養液のmr-Wnt3a、Afamin-Wnt3aおよびR-spondinの濃度を修正して培養を続けた。さらに新規に細胞を分離して、上記の2系統の基本培養液に加えてY-27632や、p38 MAP kinase inhibitorであるSB202190、GSK inhibitorであるCHIR 99021の添加の有無による細胞増殖への効果も検討したが、いずれもオルガノイドの形成には至らなかった。そこで、上記の無血清培地ではなく、10%ウシ胎仔血清を含むDMEM/F12とL-WRN(Wnt, R-spondin, Noggin)調整培養液を混和したMiyoshiら(2013)の培養方法を基本として、上記の3因子の添加の有無を比較する方法でも同様に検討したが、やはり内分泌細胞に富むオルガノイドを誘導できなかった。培養実験は何れも複数回行ったが、目的とするようなオルガノイドの作製まで至っていない。