血管異常収縮の原因分子である新規スフィンゴ脂質の産生メカニズムの解明

本年度は、血管異常収縮の原因分子であるスフィンゴシルボスホリルコリン(SPC)が、活性酸素の一種であるOHラジカル依存的に、スフィンゴミエリン(SM)から産生されることを、分子・細胞レベルで証明するための研究を行い、以下の成果を得た。1.分子レベル:OHラジカル依存的なSPC産生が特異的な反応であるかどうかを検討するため、SM分解産物について、インフユージョン導入法によるLC-MS分析を行った。これまでのSPC産生溶液においては、SMを完全に溶解させるため、TritonX-100を含む溶液を用いていたが、直接的なインフユージョン導入法では分析を阻害するため、TritonX-100を含まない溶液を用いて反応を行った。LC-MS分析の結果としては、SPCのm/zである465.3付近にシグナルの僅かな増加が認められ、また、それ以外のいくつかのm/zにおいても増加が認められた。以上のことは、OHラジカル依存的に複数のSM分解産物が生じている可能性、および、SPC産生量については、溶液組成の影響を受ける可能性を強く示唆している。2.細胞レベル:本研究では、SPC産生メカニズムの基盤として、マクロファージのライソゾーム中における赤血球消化を想定している。そこで、ヒト単球系細胞THP-1を、や融刺激によりマクロファージ様細胞に分化させた後、赤血球(オプソニン化あり・なし)や赤血球膜ゴーストを食食させ、細胞内に生じるOHラジカルの量を蛍光指示薬であるHPFを用いて検出した。結果としては、これまでの実験でSPCが産生された条件である、オプソニン化赤血球を食食させた場合のみ、OHラジカルの著明な増加が認められた。以上のことから、ヘモグロビンを含む赤血球の食食・消化の過程でOHラジカルが産生され、そのOHラジカルが赤血球膜のSMに作用してSPCが生じている可能性が強く示唆された。

本年度は、血管異常収縮の原因分子であるスフィンゴシルボスホリルコリン(SPC)が、活性酸素の一種であるOHラジカル依存的に、スフィンゴミエリン(SM)から産生されることを、分子・細胞レベルで証明するための研究を行い、以下の成果を得た。1.分子レベル:OHラジカル依存的なSPC産生が特異的な反応であるかどうかを検討するため、SM分解産物について、インフユージョン導入法によるLC-MS分析を行った。これまでのSPC産生溶液においては、SMを完全に溶解させるため、TritonX-100を含む溶液を用いていたが、直接的なインフユージョン導入法では分析を阻害するため、TritonX-100を含まない溶液を用いて反応を行った。LC-MS分析の結果としては、SPCのm/zである465.3付近にシグナルの僅かな増加が認められ、また、それ以外のいくつかのm/zにおいても増加が認められた。以上のことは、OHラジカル依存的に複数のSM分解産物が生じている可能性、および、SPC産生量については、溶液組成の影響を受ける可能性を強く示唆している。2.細胞レベル:本研究では、SPC産生メカニズムの基盤として、マクロファージのライソゾーム中における赤血球消化を想定している。そこで、ヒト単球系細胞THP-1を、や融刺激によりマクロファージ様細胞に分化させた後、赤血球(オプソニン化あり・なし)や赤血球膜ゴーストを食食させ、細胞内に生じるOHラジカルの量を蛍光指示薬であるHPFを用いて検出した。結果としては、これまでの実験でSPCが産生された条件である、オプソニン化赤血球を食食させた場合のみ、OHラジカルの著明な増加が認められた。以上のことから、ヘモグロビンを含む赤血球の食食・消化の過程でOHラジカルが産生され、そのOHラジカルが赤血球膜のSMに作用してSPCが生じている可能性が強く示唆された。