成体神経幹細胞の発生初期型神経幹細胞へのリプログラミング

申請者は、成体神経幹細胞の初期型神経幹細胞へのリプログラミングを目指し、初期型神経幹細胞特異的に発現している遺伝子候補の探索するためマイクロアレイを行った。in vitro神経発生再構築系を用いES細胞由来の神経幹細胞において後期型に比べ初期型で有意に発現が高く、また神経幹細胞の時系列に沿った後期型への分化能変化の進行に必須な転写因子であるCoupTF I/IIをknock-downした時に後期型で発現が維持され、さらにin vivoにおいて神経幹細胞を特異的に標識できるNestin 2^<nd> enahncerに不安定型のYFP改変体であるVenusを繋いだトランスジェニックマウスの胎生9日目および10日目の中枢神経系よりFACS sortingで集めた、Venus陽性細胞(in vivo初期型神経幹細胞)において、胎生16日目および18日目より集めたVenus陽性細胞(in vivo後期型神経幹細胞)より有意に発現が高い遺伝子21種類を、リプログラミングを促進する可能性のある遺伝子として選抜した。次にこれらの21種類の初期型神経幹細胞特異的な遺伝子群の内クローニングできた16遺伝子群を後期型の神経幹細胞へ強制発現したところ、一部神経細胞を作る能力を獲得する神経幹細胞が得られたが、効率よくリプログラミングができなかった。我々は、新たに初期型神経幹細胞と後期型神経幹細胞の性質を規定している可能性があるlong intergenic noncoding RNA(lincRNA)のスクリーニングを行った。我々が行ったマイクロアレイにはlincRNAのプローブが乗っており、発現が2倍以上変わっている初期型特異的な4つのlincRNAと後期型特異的な6つのlincRNAを同定した。これらのlincRNAに対するノックダウンベクターを作製し、その表現系を解析したところ、後期型特異的なlincRNAであるMalat1においてコントロールと比べ明らかな細胞増殖促進と、グリア分化能抑制が見られた。E10のマウスへin vivoウイルスインジェクションし、P20において解析した場合においてもグリア分化能の抑制が見られた。本研究は、lincRNAであるMalat1が神経幹細胞の分化能を制御することを初めて発見した。また、我々は、神経幹細胞で発現の高いRNA結合タンパク質がスプライシングを制御し分化能を制御していることを発見した。

申請者は、成体神経幹細胞の初期型神経幹細胞へのリプログラミングを目指し、初期型神経幹細胞特異的に発現している遺伝子候補の探索するためマイクロアレイを行った。in vitro神経発生再構築系を用いES細胞由来の神経幹細胞において後期型に比べ初期型で有意に発現が高く、また神経幹細胞の時系列に沿った後期型への分化能変化の進行に必須な転写因子であるCoupTF I/IIをknock-downした時に後期型で発現が維持され、さらにin vivoにおいて神経幹細胞を特異的に標識できるNestin 2^<nd> enahncerに不安定型のYFP改変体であるVenusを繋いだトランスジェニックマウスの胎生9日目および10日目の中枢神経系よりFACS sortingで集めた、Venus陽性細胞(in vivo初期型神経幹細胞)において、胎生16日目および18日目より集めたVenus陽性細胞(in vivo後期型神経幹細胞)より有意に発現が高い遺伝子21種類を、リプログラミングを促進する可能性のある遺伝子として選抜した。次にこれらの21種類の初期型神経幹細胞特異的な遺伝子群の内クローニングできた16遺伝子群を後期型の神経幹細胞へ強制発現したところ、一部神経細胞を作る能力を獲得する神経幹細胞が得られたが、効率よくリプログラミングができなかった。我々は、新たに初期型神経幹細胞と後期型神経幹細胞の性質を規定している可能性があるlong intergenic noncoding RNA(lincRNA)のスクリーニングを行った。我々が行ったマイクロアレイにはlincRNAのプローブが乗っており、発現が2倍以上変わっている初期型特異的な4つのlincRNAと後期型特異的な6つのlincRNAを同定した。これらのlincRNAに対するノックダウンベクターを作製し、その表現系を解析したところ、後期型特異的なlincRNAであるMalat1においてコントロールと比べ明らかな細胞増殖促進と、グリア分化能抑制が見られた。E10のマウスへin vivoウイルスインジェクションし、P20において解析した場合においてもグリア分化能の抑制が見られた。本研究は、lincRNAであるMalat1が神経幹細胞の分化能を制御することを初めて発見した。また、我々は、神経幹細胞で発現の高いRNA結合タンパク質がスプライシングを制御し分化能を制御していることを発見した。