再構成型転写・翻訳系を利用したリボソームの再構築

30Sサブユニットの再構成系を用いた研究本研究では昨年度までに、30Sサブユニットの構成因子である16Sr RNAと個々に調製した20種類のリボソーム蛋白質からin vitroで30Sサブユニットを再構成する反応系(In vitro 30Sサブユニット再構成反応)とpoly(U)依存的polyphenylalanine合成系を共役させた系を用いて、30Sサブユニットの再構成過程における機能性因子の効果を測定する系の構築、及びこの系を用いることで、Era、YjeQという二つのGTPaseが30Sサブユニットの再構成反応をin vitroで大きく促進することを明確に示した。当該年度ではさらに詳細な解析のため、個々に調製した20種類のリボソーム蛋白質の精製度の向上を図り、poly(U)依存的polyphenylalanine合成系でのBackgroundを低下させるとともに、混合蛋白質濃度を限界まで濃縮することで、それまで同じ系中でしか行えなかった再構成反応とpoly(U)依存的polyphenylalanine合成反応を二つのステップに分けて行えるようにした。それにより、In vitro 30Sサブユニット再構成反応をより高感度かつ活性ベースで速度論的に解析することが可能になった。また、上記の共役系においてpoly(U)依存的polyphenylalanine合成反応を、翻訳開始と翻訳終結を含むさらに高度な蛋白質合成反応であるPURE systemを使用したポリペプチド合成反応に置き換えた系を構築中であるが、こちらは感度や溶液条件の検討を行っているところである。細胞内16Sr RNAの転写反応のin vitro再構成昨年度までに、本研究では大腸菌のRNA polymeraseを用いた再構成型転写翻訳系を構築・改良を行った。本年度はanti-termination系を構成するNusAとNusGについて蛋白質調製を行い、その転写・翻訳における影響を確認した。(研究分担者との共同研究)

30Sサブユニットの再構成系を用いた研究本研究では昨年度までに、30Sサブユニットの構成因子である16Sr RNAと個々に調製した20種類のリボソーム蛋白質からin vitroで30Sサブユニットを再構成する反応系(In vitro 30Sサブユニット再構成反応)とpoly(U)依存的polyphenylalanine合成系を共役させた系を用いて、30Sサブユニットの再構成過程における機能性因子の効果を測定する系の構築、及びこの系を用いることで、Era、YjeQという二つのGTPaseが30Sサブユニットの再構成反応をin vitroで大きく促進することを明確に示した。当該年度ではさらに詳細な解析のため、個々に調製した20種類のリボソーム蛋白質の精製度の向上を図り、poly(U)依存的polyphenylalanine合成系でのBackgroundを低下させるとともに、混合蛋白質濃度を限界まで濃縮することで、それまで同じ系中でしか行えなかった再構成反応とpoly(U)依存的polyphenylalanine合成反応を二つのステップに分けて行えるようにした。それにより、In vitro 30Sサブユニット再構成反応をより高感度かつ活性ベースで速度論的に解析することが可能になった。また、上記の共役系においてpoly(U)依存的polyphenylalanine合成反応を、翻訳開始と翻訳終結を含むさらに高度な蛋白質合成反応であるPURE systemを使用したポリペプチド合成反応に置き換えた系を構築中であるが、こちらは感度や溶液条件の検討を行っているところである。細胞内16Sr RNAの転写反応のin vitro再構成昨年度までに、本研究では大腸菌のRNA polymeraseを用いた再構成型転写翻訳系を構築・改良を行った。本年度はanti-termination系を構成するNusAとNusGについて蛋白質調製を行い、その転写・翻訳における影響を確認した。(研究分担者との共同研究)