標識による影響のない機能的可視化への挑戦～カモフラージュ置換法～

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前年度に構築したS-S結合解析法は、ペプチド中に存在する複数のS-S結合の架橋様式を微量かつ簡便に解析しうる事から、当初の目的である3組のS-S結合を有するPOI類縁体においても同定可能となる事が期待された。さらに、本方法には原理上の解析不能配列が存在しない事から、従来法では困難であった蛋白質/ペプチド類のS-S結合解析に大きく寄与できると考え、本年度初めは、本方法の適応範囲の拡大および一般化に向けた、解析手法の最適化を実施した。研究代表者は、MS/MS予備測定において個々のペプチドに最適な衝突電圧を見出す必要がある点に着目した。検討の結果、MS/MS本測定時に衝突電圧を徐々に上昇させ、この時減少しつつあるプレカーサーイオンの形状変化を数値化する事により、正確かつ高効率でフラグメント化する電圧値を算出する事に成功した。これにより、煩雑な条件検討の為の予備測定を行う事無く、一段階での迅速解析が可能となった。本手法は、精密な反応制御を要する修飾反応を用いる必要がなく、また電子的制御が可能である事から、今後、蛋白質群分野を始めとした研究分野、また生産現場において幅広い活用が期待される。次に本手法を応用し、3組のS-S結合架橋様式を有するPOI-Cy3置換体の解析を試みた。これに先立ち、天然のPOIにおいてその架橋様式解析を行ったが、他の3組のS-S結合含有ペプチドよりも数多くの部分還元体が生成した。これは、POI特異的なS-S結合トポロジーに起因すると考えられたため、POIに対する還元反応条件および部分還元試料分離のためのHPLC条件の追加検討を行った。現在、得られた条件下にてPoIのS-S解析を行うとともに、PoI-cy3置換体のS-S結合解析を進めている。本解析により、PoIにおける立体構造形成、および生理活性発現に重要な役割を担う3組のS-S結合架橋様式の同一性が明らかになり、カモフラージュ置換体と本来のPOI分子との等価性評価が可能となると期待される。