ボツリヌス毒素複合体構成成分の無毒タンパク質を用いた経口的薬物送達システムの開発

使用作为肉毒杆菌毒素复合物成分的无毒蛋白质开发口服药物递送系统

• 批准号: 10J08286
• 负责人: 宮田 恵多
• 金额: $ 0.9万
• 依托单位: Tokyo University of Agriculture
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2010
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2010 至 2011
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10J08286/
• 关键词: ボツリヌス毒素; 無毒タンパク質; タンパク質間相互作用; 細胞毒性; タンパク質結晶化; 薬物送達システム; 複合体タンパク質; 分子間相互作用

ボツリヌス菌の産生する神経毒素は、A～Gの7種の血清型に分類され、種々の無毒タンパク質成分(NTNHA、HAs)と会合した毒素複合体(TC)として存在している。NTNHAは、神経毒素をプロテアーゼの分解から保護する。このNTNHAを経口的に摂取が困難なペプチド・タンパク質製剤を体内へ経口的に送達させる輸送容器として応用可能ではないかと考えられる。本研究では、D型NTNHAを新規ペプチド・タンパク質製剤輸送容器として応用するために、NTNHAのX線結晶構造解析、NTNHA-神経毒素間相互作用領域解析ならびに細胞毒性試験を行った。NTNHAの結晶化をハンギングドロップ蒸気拡散法で行った結果、0.2×0.1×0.1cmの結晶が析出した。さらに回折実験を行い、最高分解能3.9Å、P321あるいはP3121/P3221に属し、格子定数はa=b=147.85Å、c=229.74Åと測定された。神経毒素とNTNHAの相互作用領域を解析するためにC型、他のD型菌株の産生する神経毒素とNTNHAの再構成試験を行った。全ての神経毒素はD型NTNHAと複合体を形成した。それぞれの解離定数を求めた結果、C型神経毒素が最も強い値を示した。神経毒素のアミノ酸配列を比較したところC型神経毒素のC末端側配列の相同性が高い神経毒素が強い相互作用を示したことから神経毒素とNTNHAの結合は神経毒素のC末端側の関与が考えられた。NTNHAの小腸上皮細胞に対する細胞毒性を培養液中のラクテイトデヒドロゲナーゼ(LDH)の量を測定した。その結果、NTNHAを添加した細胞の培養液中のLDH量は何も添加していない細胞培養液のLDH量と同等の値を示した。このことから、NTNHAは細胞毒性を示さないことが明らかとなった。これらの結果は、新規薬物送達システムを確立する上で重要な知見であると考えられる。

ボ ツ リ ヌ ス の produce す る は 経 toxin, A ~ G の god seven の serotype に classification さ れ, kind of 々 の non-toxic タ ン パ ク qualitative composition (NTNHA, HAs) meet と し た toxin complex (TC) と し て exist し て い る. NTNHA をプロテア, neurotoxin をプロテア, ゼ, <s:1> decomposition ら, ら protection する. こ の NTNHA を 経 mouth に, take が difficult な ペ プ チ ド · タ ン パ ク quality system in tonic を へ 経 mouth に served さ せ る transport container と し て 応 may use で は な い か と exam え ら れ る. This study で は, D type NTNHA を new rules ペ プ チ ド · タ ン パ ク quality system is one of transport containers と し て 応 with す る た め に, NTNHA の X-ray crystal structure, interaction between NTNHA - god 経 toxin parsing な ら び に cytotoxicity test line を っ た. NTNHA の crystallization を ハ ン ギ ン グ ド ロ ッ プ steamed 気 company, loose line method で っ た results, 0.2 * 0.1 * 0.1 cm の crystallization precipitation が し た. Line さ ら に inflexion be 験 を い, highest decomposition can 3.9 A, P321 あ る い は P3121 / P3221 に し and lattice constant は A = b = 147.85 A, c = 229.74 A と determination さ れ た. The field of interaction of neurotoxin とNTNHA <s:1> を analysis of するために type C and other <s:1> type D strains <e:1> for the production of する neurotoxin とNTNHA <e:1> and subsequent experiments を line った. The complete て neurotoxin て type D NTNHAと complex を forms た た. The それぞれ <s:1> dissociation number を is used to find the めた result, and the が strongest <s:1> value を of type C neurotoxin is shown as た た. God 経 toxin の ア ミ ノ acid with column を compare し た と こ ろ 経 toxin の C C god end cross-draw column の identity が high strong 経 toxin が い い god を interaction in し た こ と か ら god 経 toxin と NTNHA の combining は god 経 toxin の C terminal side の masato and が exam え ら れ た. NTNHA の intestinal epithelial cells に す seaborne る cytotoxicity を medium, の ラ ク テ イ ト デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ (LDH) の を determination し た. そ の results, NTNHA を add し の in の た cell cultures of LDH quantity what は も add し て い な い の cell cultures of LDH quantity と equally の numerical を shown し た. <s:1> <s:1> と ら ら, NTNHA <s:1> cytotoxicity を shows さな となった とが とが and ら となった となった. Youdaoplaceholder3 れら the results of れら and the delivery of new drugs システムを establish で important な insights であると study えられる.

项目成果

Clostridium botulinum の産生する無毒タンパク質成分を用いたタンパク質製剤送達システムへの応用に向けた基礎的検討

利用肉毒梭菌产生的无毒蛋白质成分应用于蛋白质药物递送系统的基础研究

• 发表时间: 2010
• 作者: Kimiko Hasegawa;Takashi Matsumoto;Akihito Yamano;Keita Miyata;Ken Inui;Koichi Niwa;Toshihiro Watanabe;Tohru Ohyama;宮田恵多;犬井健;宮下慎一郎;堀内亮太;丹羽光一;宮田恵多
• 通讯作者: 宮田恵多

Clostridium botulinumの産生するC型ボツリヌス毒素の小腸上皮細胞透過機構の解析

肉毒梭菌产生的C型肉毒毒素穿透小肠上皮细胞的机制分析

• 发表时间: 2010
• 作者: Kimiko Hasegawa;Takashi Matsumoto;Akihito Yamano;Keita Miyata;Ken Inui;Koichi Niwa;Toshihiro Watanabe;Tohru Ohyama;宮田恵多;犬井健;宮下慎一郎;堀内亮太;丹羽光一;宮田恵多;犬井健
• 通讯作者: 犬井健

Characterization of sugar recognition by the toxin complex produced by Clostridium botulinum serotype C variant strain Yoichi

肉毒杆菌血清型 C 变体菌株 Yoichi 产生的毒素复合物的糖识别特性

• DOI: 10.1111/j.1574-695x.2011.00825.x
• 发表时间: 2011
• 期刊: FEMS Immunology Medicul Microbiology
• 作者: Matsuo;T.;Miyata;K.;Inui;K.;Ito;H.;Horiuchi;R.;Suzuki;T.;Yoneyama;T.;Oguma;K.;Niwa;K.;Watanabe;T.;Ohyama;T.
• 通讯作者: T.

ボツリヌス毒素複合体構成成分の非毒非血球凝集素の結晶化およびX線回折データ測定

无毒非血凝素（肉毒杆菌毒素复合物的组成部分）的结晶和 X 射线衍射数据测量

• 发表时间: 2010
• 作者: Kimiko Hasegawa;Takashi Matsumoto;Akihito Yamano;Keita Miyata;Ken Inui;Koichi Niwa;Toshihiro Watanabe;Tohru Ohyama;宮田恵多;犬井健;宮下慎一郎;堀内亮太
• 通讯作者: 堀内亮太

C 型およびD 型ボツリヌス毒素の小腸上皮細胞の透過におけるシアル酸の役割

唾液酸在 C 型和 D 型肉毒毒素渗透小肠上皮细胞中的作用。

• 发表时间: 2010
• 作者: 進士ひとみ;吉沢幸夫;相根義昌;川根武紘;狩野聡史;栗原小百合;Ken Inui;Yoshimasa Sagane;Shin-ichiro Miyashita;犬井健;相根義昌;宮下慎一郎;林慎太郎;林慎太郎;宮田恵多;Kimiko Hasegawa;犬井健;丹羽光一;犬井健;犬井 健,宮田恵多,伊藤博章,松尾 5,堀内亮太,吉田悠真,宮下慎一郎,村松将司,渡部俊弘,大山 徹,丹羽光一;丹羽光一,伊藤博章,犬井 健,宮田恵多,松尾智仁,堀内亮太,宮下慎一郎,吉田悠真,村松将司,渡部俊弘,大山 徹
• 通讯作者: 丹羽光一,伊藤博章,犬井 健,宮田恵多,松尾智仁,堀内亮太,宮下慎一郎,吉田悠真,村松将司,渡部俊弘,大山 徹