RNA/DNAハイブリッド特異的結合リガンドの創製と小分子RNA解析

RNA/DNA 杂交特异性结合配体的创建和小分子 RNA 分析

基本信息

批准号：
21655023
负责人：
西澤精一
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、『マイクロRNA(miRNA)を標的とする核酸結合リガンドを創製、これをベースにPCR増幅を不要とするmiRNA解析法を開発すること』を目的とする。具体的には、miRNAと相補的な塩基配列を有する脱塩基部位含有プローブRNA(あるいはDNA)をハイブリダイゼーションさせることで、RNA/RNA二重鎖(RNA/DNAハイブリッド)を形成、形成したRNA/RNA二重鎖(RNA/DNAハイブリッド)を蛍光性リガンドで検出するもので、核酸プローブ中に脱塩基部位を設けることで、標的RNA/RNA二重鎖(RNA/DNAハイブリッド)の特異的かつ高感度検出が可能になると期待できる。昨年度までに、蛍光性ジアミノピラジン誘導体(アミロライド)をmiRNA検出に適用しうることを見出していたが(励起380nm、検出414nm)、本年度は、アミロライドをベースとして蛍光応答特性の改良を進めた。その結果、疎水場感受性色素(DBD)をジアミノピラジン骨格に連結することで、長波長検出(～550nm)に対応した蛍光性リガンドを開発することに成功した。1et-7aを標的とした場合、0.22pmol(1.2ng)のmiRNA検出が可能であり、既存のノーザンブロッティング法とほぼ同程度の検出感度(～ng)を有している。今後、さらにリガンドの改良を進めることで、PCR増幅を不要とするmiRNA解析法になりうると期待できる。

这项研究旨在“创建靶向microRNA（miRNA）的核酸结合配体，并开发不需要PCR扩增的miRNA分析方法”。具体而言，通过与与miRNA互补的碱序列杂交含有含有位点的探针RNA（或DNA），形成RNA/RNA双链体（RNA/DNA杂交），并与荧光浓度检测形成的RNA/RNA/RNA双链（RNA/DNA混合）。通过在核酸探针中提供无碱性位点，可以预期可以对靶RNA/RNA双链体（RNA/DNA杂交）进行比较且高度敏感的检测。到去年，我们发现荧光二氨吡嗪衍生物（Amiloride）可以应用于miRNA检测（激发380 nm，检测414 nm），但是今年我们一直在改善基于Amiloride的荧光反应特征。结果，我们成功地开发了一种荧光配体，该配体通过将疏水性场敏感染料（DBD）与二米诺内吡嗪骨骼联系起来，从而支持长波长检测（高达550 nm）。当目标1ET-7A靶向时，可能会有0.22 pmol（1.2 ng）的miRNA检测，并且它具有检测灵敏度（〜ng），与现有的北面印迹方法大致相同。通过进一步改善未来的配体，可以预计可以实现消除PCR扩增需求的miRNA分析方法。