無細胞タンパク質合成系を用いた新規HIV-1薬剤耐性検査法の基盤技術開発

無細胞タンパク質合成系を用いた新規HIV-1薬剤耐性表現系検査法の開発に成功した。酵素活性を指標とした薬剤耐性検査法の技術開発を目的として研究を行い、以下の結果を得た。i)無細胞合成法により生化学的アッセイに充分量の活性を保持したPRを合成することに成功した、ii) Gag内部切断配列p2-p7をデザインしたビオチン化人工基質の切断を、アタザナビル(ATV)、アンプレナビル(APV)、ダルナビル(DRV)、インディナビル(IDV)の4種のプロテアーゼ阻害剤(PI)存在下で定量的に検出することに成功した、iii)薬剤耐性変異G48S/I54V/V82F/L90Mを持つPRについて、4種のPIに対するIC50値を算出し、野生型PRと比較解析した結果、得られた耐性評価が従来法のウエスタンブロットによる解析結果や遺伝子検査法とよく一致することを確認したiv)患者血漿由来ウイルスRNAから、サブクローニングすることなく活性を保持したプロテアーゼを調製することに成功した。スタンフォード大学Robert Shafer博士より分与された詳細な感受性検査結果をもつHIV-1感染性分子クローン8種類について、上述の4種のPIに対する耐性検査を行い、遺伝子検査および感受性検査結果と比較することで、結果の妥当性を検証した。その結果、本手法と感受性検査を比較した場合に最もよく耐性評価が一致し(22/32検体)、続いて感受性検査と遺伝子検査(18/32検体)、本手法と遺伝子検査(16/32検体)であった。このことから本手法は、定量的にPRの薬剤耐性を評価できヽ得られた解析結果は感受性検査とよく一致することが示された。本研究成果については論文投稿準備中である。

無細胞タンパク質合成系を用いた新規HIV-1薬剤耐性表現系検査法の開発に成功した。酵素活性を指標とした薬剤耐性検査法の技術開発を目的として研究を行い、以下の結果を得た。i)無細胞合成法により生化学的アッセイに充分量の活性を保持したPRを合成することに成功した、ii) Gag内部切断配列p2-p7をデザインしたビオチン化人工基質の切断を、アタザナビル(ATV)、アンプレナビル(APV)、ダルナビル(DRV)、インディナビル(IDV)の4種のプロテアーゼ阻害剤(PI)存在下で定量的に検出することに成功した、iii)薬剤耐性変異G48S/I54V/V82F/L90Mを持つPRについて、4種のPIに対するIC50値を算出し、野生型PRと比較解析した結果、得られた耐性評価が従来法のウエスタンブロットによる解析結果や遺伝子検査法とよく一致することを確認したiv)患者血漿由来ウイルスRNAから、サブクローニングすることなく活性を保持したプロテアーゼを調製することに成功した。スタンフォード大学Robert Shafer博士より分与された詳細な感受性検査結果をもつHIV-1感染性分子クローン8種類について、上述の4種のPIに対する耐性検査を行い、遺伝子検査および感受性検査結果と比較することで、結果の妥当性を検証した。その結果、本手法と感受性検査を比較した場合に最もよく耐性評価が一致し(22/32検体)、続いて感受性検査と遺伝子検査(18/32検体)、本手法と遺伝子検査(16/32検体)であった。このことから本手法は、定量的にPRの薬剤耐性を評価できヽ得られた解析結果は感受性検査とよく一致することが示された。本研究成果については論文投稿準備中である。