ボトムアップ的ライブラリー構築による抗体様RNA分解酵素の創製

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本研究では、ヒト由来のRNA分解酵素に対して機能性人工ペプチドを導入することによって、本来の基質であるRNAとは異なる標的分子認識能を新たに付与した人工酵素の調製系を確立することを目指している。本年度の研究成果は以下の通りである。1.人工ペプチド挿入RNA分解酵素の調製系の最適化前年度に巻き戻し操作によって、不溶性画分から調製した人工ペプチド挿入RNA分解酵素は酵素活性を示したが、巻き戻し操作後の試料には多種の分子種が混在していた。そこで巻き戻し操作の更なる検討を行った結果、非還元状態での電気泳動において、ほぼ単一バンドを与える条件を見出すことができた。2.人工ペプチド挿入RNA分解酵素の機能評価tRNAを用いてRNA分解活性を評価した結果、人工ペプチド挿入RNA分解酵素は活性を示す一方で、コントロール酵素と比較して若干、低い活性であったことから、外来ペプチド挿入に伴う足場タンパク質への影響が見られた。フローサイトメトリーにより標的抗原発現細胞に対する結合活性を評価した結果、有意な結合を確認できなかったことから、人工ペプチド挿入箇所の最適化、機能性向上が重要であることがわかった。3.変異導入RNA分解酵素の作製RNA分解酵素の安定な分泌発現を目的として、宿主に対する細胞毒性を軽減するために、酵素活性部位に存在するアミノ酸残基に対して変異導入を行った。その結果、変異体は可溶性タンパク質として分泌可能であったことから、RNA分解酵素の安定なファージ提示系構築に向けて前進した。