Development and application of novel biophysical methods to elucidate the structure and dynamics of membrane proteins

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Das vorliegende Vorhaben zielt auf die Entwicklung eines neuen Ansatzes zur Untersuchung von Membranproteinen und - peptiden. Dieser Ansatz ergibt sich aus der Kombination von Infrarotspektroskopie und Röntgenbeugung. Die Grundlage der Methode ist die Ableitung räumlicher Randbedingung, z.B. in Hinblick auf die räumliche Lage bestimmter Peptidesegmente, aus der spezifischen Isotopen-Markierung (13C = 18 O). Durch die Präparation hochorientierter Membranstapel auf Festkörper-Trägern und die präzise Kontrolle der Unordnung (statischer und dynamischer Natur) der Membransegmente mittels Röntgenreflektivität lassen sich dann Orientierung des Peptidketten-Segmentes und Orientierungsunordnung der Lipidmembran entfalten. Schließlich wird durch Energieminimierung innerhalb von Molekulardynamiksimulationen die Struktur verfeinert (refined). Gegenstände dieser Untersuchungen sind drei klinisch relevanten, virale Ionenkanäle: Influenza A M2, Influenza B NB und HIV vpu. Diese Membranproteine sind alle homo-oligomere Ionenkanäle, in deren Handhabung die Antragsteller bereits Erfahrung gesammelt haben. Nach Erarbeitung der backbone-Struktur des Proteins, soll dann die spezifische Wechselwirkung des Proteins mit der Lipidmembran durch Neutronen- und Röntgenstreuung untersucht werden. Schließlich soll der Einfluss der (i) Kettenlänge, (ii) der Temperatur, (iii) des Sättigungsgrades der Acylketten, und (iv) des Cholesteringehaltes untersucht werden. Umgekehrt kann der konzentrationsabhängige Einfluss der Proteine auf die Membranstruktur festgestellt werden, z.B. Doppelschichtdicke, Kettenordnung, Kopfgruppenhydratisation. Schließlich soll der vorliegende Antrag auch dazu dienen, anhand von den oben genannten Systemen und der komplementären Information der FITR auch die Methodenentwicklung der Streuexperimente an hochorientierten Membranen voranzutreiben. Zusammenfassend schlagen wir eine neuartige Methode zur Bestimmung der backbone-Struktur unter physiologischen Bedingungen vor. Mit der gewonnen Strukturinformation soll dann die Peptid-Lipid Wechselwirkung aufgeklärt werden.