GPCRシグナル複合体細胞内輸送の時空間的制御に関する検討

GHRH受容体のGHRH刺激後の細胞表面発現量変動についての検討昨年度作成したGHRHRとタンパク質A両者を発現する細胞系を用いて、この受容体がGHRH刺激後に、細胞表面受容体発現量がどのように変化するのか、またタンパク質Aの発現が受容体の細胞表面発現にどのように影響するかについて抗GHRHR抗体を用いる蛍光免疫染色を行い、Flowcytometry法により定量を行った。その結果、受容体全長を発現させたものでは、GHRH刺激により受容体の細胞表面発現量が経時的に増加したのに対し、受容体のC末4アミノ酸欠損させたものではGHRH刺激にもかかわらず受容体の細胞表面発現量は変化しなかった。これは、受容体のC末4アミノ酸が受容体の細胞表面発現量は変化に重要であることを考えている。さらに受容体と相互作用する細胞内タンパク質Aを受容体とともに共発現させるとGHRH刺激後、一過性に受容体の細胞表面発現量は減少したがその後、増加に転じた。受容体の細胞表面発現量はリガンドであるGHRH刺激後増加したが、タンパク質A存在下では受容体の細胞内トラフィックが変化することが明らかになった。GHRHRのシグナル伝達におけるタンパク質Aの関与の検討GHRHRは、Gsタンパク質共役型GPCRであり、リガンドであるGHRHの結合により、細胞内cAMP濃度を亢進する。このGHRH刺激による細胞内cAMP濃度亢進においてGHRHRとタンパク質Aとの相互作用がどのように影響を与えているかについて検討を行った。すな診ち、cAMP濃度の細胞内変化をcAMP濃度に応答するプロモータとしてCRE(cAMP response element)、リポーター遺伝子のルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだプラスミドをGHRHRとタンパク質Aを発現する細胞にトランスフェクションを行い、cAMPレポーターアッセイ系の確立を行った。

GHRH受容体のGHRH刺激後の細胞表面発現量変動についての検討昨年度作成したGHRHRとタンパク質A両者を発現する細胞系を用いて、この受容体がGHRH刺激後に、細胞表面受容体発現量がどのように変化するのか、またタンパク質Aの発現が受容体の細胞表面発現にどのように影響するかについて抗GHRHR抗体を用いる蛍光免疫染色を行い、Flowcytometry法により定量を行った。その結果、受容体全長を発現させたものでは、GHRH刺激により受容体の細胞表面発現量が経時的に増加したのに対し、受容体のC末4アミノ酸欠損させたものではGHRH刺激にもかかわらず受容体の細胞表面発現量は変化しなかった。これは、受容体のC末4アミノ酸が受容体の細胞表面発現量は変化に重要であることを考えている。さらに受容体と相互作用する細胞内タンパク質Aを受容体とともに共発現させるとGHRH刺激後、一過性に受容体の細胞表面発現量は減少したがその後、増加に転じた。受容体の細胞表面発現量はリガンドであるGHRH刺激後増加したが、タンパク質A存在下では受容体の細胞内トラフィックが変化することが明らかになった。GHRHRのシグナル伝達におけるタンパク質Aの関与の検討GHRHRは、Gsタンパク質共役型GPCRであり、リガンドであるGHRHの結合により、細胞内cAMP濃度を亢進する。このGHRH刺激による細胞内cAMP濃度亢進においてGHRHRとタンパク質Aとの相互作用がどのように影響を与えているかについて検討を行った。すな診ち、cAMP濃度の細胞内変化をcAMP濃度に応答するプロモータとしてCRE(cAMP response element)、リポーター遺伝子のルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだプラスミドをGHRHRとタンパク質Aを発現する細胞にトランスフェクションを行い、cAMPレポーターアッセイ系の確立を行った。