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発光イメージングを利用したDNA修復経路の破綻による神経症状発症機構の解明

利用发光成像阐明 DNA 修复途径破坏引起的神经系统症状的机制

基本信息

批准号：
11J02843
负责人：
落合博
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2012
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J02843/
关键词：
TALEN 放射線ゲノム不安定性小頭症 zinc-finger nucleases

项目摘要

胎内で放射線を被爆することで,高頻度に小頭症を発症することが知られている。また放射線はDNA二重鎖切断(DSB)を誘導し,DSB修復機構やゲノム安定性の維持に先天的な異常を持つ患者の多くにおいて小頭症が認められることから,DSB修復機構やゲノム安定性の維持と小頭症には密接な関係があると考えられる。しかし,疾患モデル神経幹細胞が樹立されておらず小頭症の発症メカニズムは明らかになっていない。昨年度に、人工ヌクレアーゼzinc-finger nuclease (ZFN)を利用してヒト培養細胞に小頭症の原因遺伝子領域へ外来遺伝子の導入を試みたが,効率が低く,両対立遺伝子に導入した細胞株を樹立することができなかった。本年度では,ZFNよりも結合特異性が高いとされる人工ヌクレアーゼtranscription activator-like effector nuclease (TALEN)を利用したゲノム編集技術の利用を検討した。まず,機能的なTALENを作製するために,ポリメラーゼ連鎖反応を利用した簡便なTALEN作製システムを確立した。このシステムを利用して,小頭症原因遺伝子の一つであるBUB1B遺伝子領域に標的を持つTALENを作製した。このTALEN発現ベクターとターゲティングベクターをヒト直腸結腸癌細胞HCT116に共導入し,薬剤選抜を行った。その結果,覧得られたクローンのほぼすべてが少なくとも片アレルに外来遺伝子の挿入が確認され,さらに約1/20のクローンで両アレルに外来遺伝子の挿入が認められた。このことから,TALENを利用することで,ヒト培養細胞において高効率で特定遺伝子領域に外来遺伝子を挿入することができることがわかった。今後この技術を利用し,小頭症発症に関係する遺伝子を破壊したヒト疾患モデル神経幹細胞の作製が期待できる。

The radioactive rays in the fetus were exposed, and the high-frequency microcephaly syndrome was known to occur. Radiation is used to induce DNA double lock severing (DSB), and the stability of the DSB repair mechanism is maintained to maintain the congenital abnormality of the patient.においてmicrocephalyがidentificationめられることから, DSB repair mechanism やゲノムstability のmaintenanceとmicrocephaly にはclose connectionなrelational があると考えられる.しかし, disease モデル神経Stem cells がEstablishment されておらずMicrocephaly の発 syndrome メカニズムは明らかになっていない. Yesterday's year, artificial ヌクレアーゼzinc-finger nuclease (ZFN) Trial on the introduction of foreign genetic materials in the field of microcephaly causing microcephaly using cultured cellsみたが, efficiency is low く, 両対establishment 伝子に introduced したcell line をestablishment することができなかった. This year's では, ZFN よりも high binding specificity いとされる artificial ヌクレアーゼtranscription activator-like effector nuclease (TALEN)したゲノムediting technologyのutilizationを検した.まず, functional なTALEN を production するために, ポリメラーゼ chain reaction を use した simple なTALEN production システムを established した. The このシステムを utilizes して, and the の一つであるBUB1B つであるBUB1B legacy に子 field is produced by TALENを.このTALEN発成ベクターとターゲティングベクターをヒトrectal and colon cancer cell HCT116 was co-introduced into し, 薬艤选抜を行った.そのRESULTS,See the insertion of られたクローンのほぼすべてが小なくとも片アレルにforeign widow 伝子のがConfirmationされ,さらにAbout 1/20のクローンで両アレルに Foreign relics 伝子の inserted が见められた. TALEN uses TALEN to culture cells efficiently. The rate is a specific area of relics that are imported from abroad. In the future, we are looking forward to the utilization of technology and the production of stem cells that are related to microcephaly and other diseases.