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発光イメージングを利用したDNA修復経路の破綻による神経症状発症機構の解明

利用发光成像阐明 DNA 修复途径破坏引起的神经系统症状的机制

基本信息

批准号：
11J02843
负责人：
落合博
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2012
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J02843/
关键词：
TALEN 放射線ゲノム不安定性小頭症 zinc-finger nucleases

项目摘要

胎内で放射線を被爆することで,高頻度に小頭症を発症することが知られている。また放射線はDNA二重鎖切断(DSB)を誘導し,DSB修復機構やゲノム安定性の維持に先天的な異常を持つ患者の多くにおいて小頭症が認められることから,DSB修復機構やゲノム安定性の維持と小頭症には密接な関係があると考えられる。しかし,疾患モデル神経幹細胞が樹立されておらず小頭症の発症メカニズムは明らかになっていない。昨年度に、人工ヌクレアーゼzinc-finger nuclease (ZFN)を利用してヒト培養細胞に小頭症の原因遺伝子領域へ外来遺伝子の導入を試みたが,効率が低く,両対立遺伝子に導入した細胞株を樹立することができなかった。本年度では,ZFNよりも結合特異性が高いとされる人工ヌクレアーゼtranscription activator-like effector nuclease (TALEN)を利用したゲノム編集技術の利用を検討した。まず,機能的なTALENを作製するために,ポリメラーゼ連鎖反応を利用した簡便なTALEN作製システムを確立した。このシステムを利用して,小頭症原因遺伝子の一つであるBUB1B遺伝子領域に標的を持つTALENを作製した。このTALEN発現ベクターとターゲティングベクターをヒト直腸結腸癌細胞HCT116に共導入し,薬剤選抜を行った。その結果,覧得られたクローンのほぼすべてが少なくとも片アレルに外来遺伝子の挿入が確認され,さらに約1/20のクローンで両アレルに外来遺伝子の挿入が認められた。このことから,TALENを利用することで,ヒト培養細胞において高効率で特定遺伝子領域に外来遺伝子を挿入することができることがわかった。今後この技術を利用し,小頭症発症に関係する遺伝子を破壊したヒト疾患モデル神経幹細胞の作製が期待できる。

The radiation in the fetus is exploded, and the high frequency of microcephaly is detected. DSB repair mechanism must maintain stability of DNA and maintain congenital abnormalities in patients with microcephaly. The stem cells of brain stem cells were established in the early stages of microcephaly. In the past year, artificial zinc-finger nucleotide (ZFN) has been used to introduce foreign genes into microcephaly in cultured cells. The efficiency of introducing foreign genes into microcephaly cells is low. This year, the use of ZFN and its binding specificity has been investigated in the context of the artificial transcription activator-like effector nucleotide (TALEN). The TALEN function is easy to control, and the chain reaction is easy to use. The use of this information, microcephaly causes of a child's disease, BUB1B inheritance sub-field target to maintain TALEN control TALEN was found to be co-introduced into colorectal cancer cell line HCT116. As a result, the number of foreign genes detected in the sample was reduced, and the number of foreign genes detected in the sample was about 1/20 of the total number of samples detected. TALEN can be used to culture cells with high efficiency and to introduce foreign genes into specific gene domains. In the future, the technology will be used to develop microcephaly, and it is expected that the gene will be used to develop microcephaly.