人工的ヘテロダイマー化による光合成反応中心の電子移動非対称化機構の解析

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本研究課題は、緑色硫黄細菌Chlorobaculum(Cba.)tepidumのホモダイマー光合成反応中心(RC)を、コアタンパク質遺伝子(pscA)の偽二倍体化と部位特異的変異導入によりヘテロダイマー化し、RC内で起こる非対称な電子移動のメカニズムを明らかにすることを目指している。本年度は、2種類の変異体RCについて分光学的な解析を行った。また昨年度末の時点で難航していた人工ヘテロダイマーRCの精製方法の確立を進めた。昨年度までに確立したCba.tepidumの発現プラスミド発現系を利用し、P840近傍の水素結合可能な位置に存在するLeuとValの変異体RCを作製した。HisタグとStrepタグのタンデムアフィニティクロマトグラフィにより変異体ホモダイマーRCを精製し、フーリエ変換赤外分光法によりP840^+/P840の差スペクトルを解析したところ、どちらの変異体でもクロロフィル色素のケトカルボニル基の伸縮振動バンドが変化した。さらに分光電気化学的解析から、どちらの変異体RCもP840^+/P840の電位を上昇させることがわかった。これは緑色硫黄細菌のRCにおいて部特異的変異体の作製と解析に成功した初めての例である。一方、人工ヘテロダイマーRCの精製については、タンデムアフィニティクロマトグラフィの条件最適化を検討した。その結果、StrepタグとHisタグをもつヘテロダイマーRCのStrep-tactin固定化樹脂への吸着は塩濃度に強く依存しており、わずか100mM程度であっても回収率が劇的に低下することがわかった。Hisタグ精製で得られたHisタグ付きRCの画分の脱塩することにより、最適化したタンデムアフィニティ精製で分光解析に十分な収量の変異体ヘテロダイマーRCが得られることがわかった。