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微量血液由来のiPS細胞を用いた先天性心臓イオンチャネル疾患の心筋細胞解析系確立

利用少量血液来源的iPS细胞建立先天性心脏离子通道病心肌细胞分析系统

基本信息

批准号：
11J30002
负责人：
関倫久
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2013
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J30002/
关键词：
再生医療 iPS細胞心筋細胞

项目摘要

微量血液由来のiPS細胞を用いて先天性心臓イオンチャネル疾患の心筋細胞解析系を確立するため、我々は微量血液から培養されたヒト末梢血T細胞より樹立されたiPS細胞の解析を行った。これらのiPS細胞がT細胞受容体の遺伝子構成を内包することをシークエンスにより遺伝子配列レベルで確認した。これらを心筋へ分化誘導し、表現型の解析を進めた。分化プロトコールは浮遊培養系を用い、浮遊培養開始から4日目まではWnt3aを作用させ、以降はWnt3aを除き浮遊培養を継続した。同様の分化の培養系がES細胞、レトロウイルスで作製した線維芽細胞由来iPS細胞で拍動胚様体を出現させることを確認した。それらの細胞と同様に、センダイウイルスで作成したT細胞由来iPS細胞の分化において、浮遊培養開始後10-15日目頃より拍動する胚様体が出現することを確認した。我々はさらにこのようにして得られた拍動する胚様体の解析を進めた。これらの胚様体内には機能的な心筋細胞が存在し、RNAレベルで心筋特異的マーカー(GATA4、Mef2c、ANP、αMHC、βMHC、MLC2a、MLC2v、MYH6、cTNNI)を発現していること、タンパクレベルでも同様に心筋特異的マーカー(Actinin、Nkx2.5、Troponin I、ANP)が発現していることをRTPCR, 免疫染色で確認した。また、これら拍動する胚様体をin-vitro多点電位記録システムであるMEAシステムのマルチ電極アレーディッシュに乗せると、1～2日で接着し、底面の電極で活動電位を記録することができた。この実験系を用いて各種抗不整脈薬(Na, Ca, Kチャネルブロッカー)に対する心筋細胞の応答性を解析した。T細胞由来の心筋細胞は遺伝子再構成を内包するため、その影響が危惧されたが、各種チャネルブロッカーに生理的な反応を示すことを確認した。さらに、これら心筋細胞は電子顕微鏡レベルで機能的心筋としての特徴を備えていることを確認した。以上の結果を論文として報告、また、皮膚由来のips細胞において先天性QT延症候群の患者由来のiPS細胞から作られた心筋細胞が、in vitroで病態の再現が可能であることを確認し、報告した。我々が確立した微量血液由来のiPS細胞が先天的心臓イオンチャネル疾患の心筋細胞の解析に応用可能である可能性が示された。

Micro-blood derived iPS cells were used to establish a cardiac muscle cell analysis system for congenital heart disease. The gene composition of iPS cells and T cell receptors is included in this study. In addition, the differentiation of the heart muscle and the analysis of the phenotype are advanced. The differentiation of the culture system in suspension, the start of the suspension culture, Wnt3a, and the removal of Wnt3a. The same differentiation culture lines were identified as ES cells, iPS cells, and embryonic embryos. It was confirmed that T cells were produced from iPS cells and that embryos appeared 10-15 days after the start of the culture. I'm going to have to go through the motions. The presence of functional cardiac muscle cells in the embryo, the presence of RNA, the presence of cardiac muscle specific cells (GATA4, Mef2c, ANP, αMHC, βMHC, MLC2a, MLC 2v, MYH6, cTNNI), and the presence of cardiac muscle specific cells (Actinin, Nkx2.5, Troponin I, ANP) were confirmed by RTPCR and immunostaining. 1 - 2 days later, the electrode on the bottom of the electrode is recorded. This system uses a variety of anti-inflammatory agents (Na, Ca, K) to analyze the response of cardiac muscle cells. T cell origin and gene recombination in the heart muscle cells, the impact of the crisis, a variety of biological reactions to confirm In addition, the electronic microscope can be used to confirm the characteristics of the muscle cells. The above results are reported and confirmed in this paper. Furthermore, it is possible for iPS cells derived from the skin to function as cardiac muscle cells from iPS cells derived from patients with congenital QT delay syndrome, and for the disease to reappear in the vitro. We have established the possibility that trace amounts of iPS cells derived from congenital heart disease may be used for analysis of cardiac muscle cells.