エチレン受容体タンパク質の分解調節機構解明とその応用に関する研究

乙烯受体蛋白降解调控机制阐明及其应用研究

基本信息

批准号：
11J40033
负责人：
棚瀬京子 (日和佐京子)
金额：
$ 1.54万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2013
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J40033/
关键词：
エチレン受容体メロン 1-MCP 果実成熟組換え体抗体定量的PCR解析

项目摘要

エチレン受容体の分解機構解明に関わる実験には、保持しているエチレン受容体タンパク質の抗体に特異性があることが重要である。しかし、既存の抗体では特異性を砲認できなかった。既存の抗体は古いものでは10年以上のものもあるため、抗体の状態が悪くなっていることも考慮された。そこで、新しくペプチド抗体を外注した。続いて、大腸菌に3種のメロンエチレン受容体タンパク質を発現させ、これを使って新しい抗体の特異性を確認することを試みた。しかし、pQE30Xaへの導入コンストラクトでは、受容体タンパク質が発現しなかった。先行研究で、大腸菌発現ベクターであるpET32aにエチレン受容体遺伝子を導入した場合では、タンパク質の発現に成功した例があり、現在はこのベクターのコンストラクトを作成中である。また、実験4で作出したメロンのエチレン受容体を発現しているトマトの葉、および実生から膜タンパク質を抽出し、抗体の特異性の確認に使用することを試みた。しかし、このウエスタンによる結果は不十分な結果に終わっている。ただし、膜タンパク質のマーカーであるHSC70の抗体を使ったウエスタンでは、目的サイズのバンドが確認できており、膜タンパク質の抽出は問題ないことが確認できている。また、エチレン受容体の分解に関わると推定される配列の受容体分解への関与を調べる研究(実験4)では、昨年度作出したメロンのアミノ酸置換導入エチレン受容体を導入したトマトの遺伝子の発現をリアルタイムPCRで確認した。現在は、導入遺伝子シングルコピーのT_1個体の栽培を行っており、開花からBreaker(催色期)まで、およびBreakerからRed(赤熟期)までの果実成熟日数の調査を実施している。また、葉の老化や花持ちおよび形態的な変化についても観察を行っているが、これらについては顕著な変化は見られていない。

在阐明乙烯受体降解机理的实验中，重要的是，保留乙烯受体蛋白的抗体是特异性的。但是，现有抗体无法识别特异性。较旧的抗体年龄超过10岁，因此还认为抗体状态更糟。因此，将新的肽抗体外包。然后，我们试图在大肠杆菌中表达三种瓜乙烯受体蛋白，这些素蛋白用于确认新抗体的特异性。然而，将构造构建到PQE30XA中并未表达受体蛋白。在先前的研究中，当将乙烯受体基因引入PET32A（大肠杆菌表达载体）时，有一个成功表达蛋白质的例子，并且目前正在创建该载体的构造。此外，我们试图从实验4中产生的瓜乙烯受体中提取番茄叶和幼苗的膜蛋白，并使用它们来确认抗体的特异性。但是，西方的结果不足。然而，在使用HSC70抗体的西方人中，膜蛋白的标志物已确认目标尺寸，并且已经证实，提取膜蛋白没有问题。此外，在一项研究（实验4）中，研究了序列的参与，这些序列被认为与乙烯受体降解有关受体降解中的降解，我们证实了在上一年通过实时实时PCR创建的氨基酸 - 拟合乙烯受体引入的西红柿中基因的表达。目前，我们正在培养一个T_1转基因的单个副本，并正在研究从开花到断裂器（着色阶段）以及从断裂器到红色（红色成熟阶段）的果实成熟天数（红色成熟阶段）。我们还观察到叶片衰老，开花寿命和形态学变化的变化，但是在这些变化中没有观察到显着变化。