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機能遺伝子のmRNAを標的としたFISH法の開発と脱窒素細菌の網羅的検出へ適用

针对功能基因mRNA的FISH方法开发及其在反硝化细菌综合检测中的应用

基本信息

批准号：
22651031
负责人：
荒木信夫
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Nagaoka National College of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

生物学的窒素除去プロセスを開発し,高効率に運転管理するためには,プロセスの鍵を握る微生物群を検出し,それらを制御する必要がある.特に,脱窒素細菌群は系統学的に多様性が大きく,従来の16S rRNAを標的としたFISH法で網羅的に検出することはできない.そこで本研究では,脱窒素細菌群が保有するnirS遺伝子に着目し,その転写物であるnirS mRNAを標的とした排水処理プロセス中の脱窒素細菌群のFluorescence in-situ hybridization(FISH)法による検出法の開発を行った.FISH法に用いるプローブには,より広い検出レンジで標的微生物群を検出可能かつ高い特異性を達成可能なオリゴヌクレオチドプローブを採用した.また,通常のFISH法では細胞内低コピー分子であるmRNAの検出が困難であると考えられるため,Tyramide signal amplification(TSA)反応を利用した高感度FISH法のCatalyzed reporter deposition(CARD)-FISH法の適用を行なった.まず,nirS mRNA配列に特異的なnirS2RプローブのΔG°を計算し,高い親和性を持つプローブであることを確認した.次に,5'にHorseradish peroxidase(HRP)を標識したnirS2RプローブのFISHプローブとしての有効性の実験的評価を,Clone-FISH法を用いて行った.その結果,nirS2RプローブはFISHプローブとして適用可能であり,最適条件下においては,汚泥内で発現したnirS mRNAのみを特異的に検出可能であることを示した.そして本手法を,純粋菌株nirS遺伝子を保有するみPseudomonas stutzeriに適用したところ,低酸素条件下で培地に亜硝酸塩添加した場合にnirS mRNA由来と考えられるシグナルを得ることに成功した.また,し尿を処理する実排水処理サンプルに対しCARD-FISH法を適用したところ,一部の菌体からmRNA由来と考えられるシグナルが検出できた.ただし,DAPI染色細胞に対するnirS2Rプローブ検出細胞の検出率は0.1%以下であったため,今後,本手法の妥当性・有用性をより詳細に検討する必要がある.

Biological hormone removal is necessary for development, efficient management, identification and control of microbiota. In particular, the phylogenetic diversity of the isolated bacterial population is significant, and the 16S rRNA target is detected by FISH. In the present study, Fluorescence in-situ hybridization(FISH) method was used to detect the presence of nirS mRNA in the expression of nirS mRNA. Find out the target microbiota in a wide range of ways to find out what is possible and achieve high specificity. We can use it to make it possible. In general, it is difficult to detect the mRNA of intracellular low-level molecules by FISH method, and the application of Catalyzed reporter deposition(CARD)-FISH method by using high sensitivity FISH method is very difficult. NirS mRNA alignment specific ΔG° was calculated, and high affinity was confirmed. In addition, 5 'Horseradish peroxidase(HRP) was identified by NirS2R and FISH and evaluated by Clone-FISH. The results of FISH showed that nirS2R mRNA could be detected in sludge under optimal conditions. In this way, the pure strain nirS gene can be maintained in the presence of Pseudomonas stutzeri, which is suitable for cultivation under low acid conditions. In addition, CARD-FISH method was applied to the drainage treatment server for urine treatment, and the origin and analysis of mRNA from a part of the bacteria were detected. The detection rate of DAPI staining cells is less than 0.1%. In the future, the appropriateness and usefulness of this method should be discussed in detail.