Proteinfaktoren der Vakuolenfusion: Rolle der kovalenten Modifikation der VTC-Proteine

点击翻译按钮获取中文摘要

Intrazelluläre Membranfusion wird durch einen konservierten enzymatischen Apparat katalysiert. Kinetische Analysen in verschiedenen Systemen führten zu einer groben Zuordnung der bislang bekannten Proteinfaktoren zur Aktivierung der Membranen für die gegenseitige Erkennung, zu ihrer Bindung aneinander und zur eigentlichen Fusion. Die Fusion von Vakuolen aus S. cerevisiae ist ein Modellsystem zum Studium der intrazellulären Membranfusion. Der Vorgang kann in vivo wie auch in vitro analysiert werden. Ein Komplex von VTC-Proteinen ist ein wichtiger Regulator des Vorgangs, der sowohl die Aktivierung der Membranen für die gegenseitige Bindung kontrolliert, als auch die letzte Phase der Reaktion, die zur Verschmelzung der Membranen führt. Vorläufige Untersuchungen haben ergeben, dass der VTCKomplex mehrfach kovalent modifiziert wird. Änderungen im Muster der kovalenten Modifikation korrelieren mit erheblichen Änderungen der Fusionsaktivität. Ziel des Projektes ist, das Muster kovalenter Modifikationen des VTC-Komplexes in mehrfacher Hinsicht zu charakterisieren: 1. Identifizierung der Art der Modifikationen und der betroffenen Aminosäuren 2. Mutation der betroffenen Aminosäuren 3. Analyse der Auswirkungen dieser Änderungen auf die Fusionsaktivität und auf die Interaktion des VTC-Komplexes mit anderen Membranproteinen. 4. Anreicherung der verantwortlichen proteinmodifizierenden Enzyme durch Analyse des vakuolären Gesamtproteoms und Isolierung von VTC-interagierenden Proteinen. Aus der Kombination massenspektrometrischer Analyse zur Identifizierung der Modifikationen und der vielfältigen Möglichkeiten von S. cerevisiae, Mutationen effizient zu generieren und deren Effekt in vivo wie auch in vitro zu untersuchen, ergeben sich hervorragende Erfolgsaussichten.