組換えBAC遺伝子導入ラットを用いたAPCタンパク質の炎症抑制ドメインの同定

重组BAC转基因大鼠APC蛋白抗炎结构域的鉴定

• 批准号: 11J03639
• 负责人: 吉見 一人
• 金额: $ 0.83万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2011
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2011 至 2012
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J03639/
• 关键词: APC; ラット; DLG5; DSS; 大腸炎; BACトランスジェニックモデル

本研究は、動物モデルを利用してDSS誘発大腸炎に影響を及ぼすAPCタンパク質の責任ドメインを同定することを目的とし、正常および組み換えApc遺伝子を用いてTransgenicラットの作製およびDSS誘発大腸炎の感受性を検討することとした。ナショナルバイオリソースプロジェクトラットで保存、提供されているF344-BACクローン大腸菌株を用いてBACクローンを増幅、抽出および精製した。精製した直鎖状BACDNAを、顕微授精法によりKADラット胚の雄性前核に顕微注入を行い、102個の受精卵を移植した結果、22頭のトランスジェニックラットを作出した。しかし、これらの中にトランスジェニック陽性の個体は検出されなかった。そこで、タンパク質レベルでDSS誘発大腸炎に影響を及ぼすAPCタンパク質C末端の責任ドメインを同定することとした。FLAGタグ化ラットAPC-C末端ベクター、およびV5タグ化ラットDLG1、DLG5ベクターをそれぞれ作製した。それらをHela細胞に共トランスフェクションし、免疫沈降法によりAPCタンパク質C末端領域と各タンパク質との相互作用を検討した。この結果、APCタンパク質C末端領域は、従来結合が確認されているEB1だけでなく、細胞接着に関与するアダプタータンパク質であるDLGファミリーのDLG1、DLG5との結合が観察された。また多重蛍光免疫染色の結果、DLG5はAPCと同様に、大腸炎症領域において血管内皮細胞に強い発現が観察された。従って、APCタンパク質のDLG結合ドメインがDSS誘発大腸炎に影響を及ぼすAPCタンパク質の責任ドメインということが示唆された。近年DLG5は、ヒト炎症性腸疾患の関連遺伝子として報告されており、本研究結果は、APCタンパク質が持つ大腸炎発症及び粘膜修復過程における新たな分子メカニズムを示す重要な知見となる。また、APCとDLG5との相互作用がヒト炎症性腸疾患の病態解明に関与することを示唆するものである。

This study investigated the effects of DSS-induced colitis on animals and their role in determining APC quality and susceptibility to DSS-induced colitis. F344-BAC strain was isolated from E. coli and used for amplification, extraction and purification. 102 fertilized eggs were transplanted into the male pronucleus of KAD embryos by micro-insemination. 22 embryos were transplanted into the male pronucleus. The positive individuals were identified. DSS-induced colitis and APC-induced colitis are the same as DSS-induced colitis. FLAG To investigate the interaction between proteins in Hela cells, APC proteins in the C-terminal domain and proteins by immunoprecipitation. As a result, APC protein C-terminal domain is identified by binding to DLG1 and DLG5, which are associated with cell adhesion. The results of multiple light immunostaining showed that DLG5 was associated with APC and was strongly detected in vascular endothelial cells in the field of colorectal inflammation. The influence of APC on DSS-induced colitis and the role of APC in DSLG are discussed. DLG5 has been reported to be associated with inflammatory bowel disease in recent years. The results of this study provide important new insights into the molecular mechanism of APC in the development of colitis and mucosal repair. The interaction between APC and DLG5 is related to the pathogenesis of inflammatory bowel disease.

项目成果

Apc変異ラットにおけるDSS誘発大腸炎感受性機構の解明

阐明 DSS 诱导 Apc 突变大鼠结肠炎易感性的机制

• 发表时间: 2012
• 作者: 吉見一人;田中卓二;芹川忠夫;庫本高志
• 通讯作者: 庫本高志