マラリア原虫ミトコンドリアゲノムの遺伝子転写調節機構の解明

本年度は、(1)マラリア原虫のエネルギー転換系遺伝子の転写調節因子の探索、および、(2)乳酸によるマラリア原虫の発育遅延の解析、においてそれぞれ以下に示す成果が得られた。(1)マラリア原虫のエネルギー転換系遺伝子の転写調節因子の探索前年度、マラリア原虫のin vitro培養系において、グルコース、乳酸や鉄の濃度、ジクロロ酢酸ナトリウ(DCA : ピルビン酸脱水素酵素キナーゼ阻害剤)の添加について検討した結果、乳酸がエネルギー代謝系遺伝子の転写を変化させることが予測された。この結果を受け、乳酸がマラリア原虫に与える影響についてreal-timePCRによるより詳細な解析を行った。解析には、解糖系3つ、TCA回路2つ、および、呼吸鎖4つの遺伝子を用い、乳酸(30mMおよび60mM)添加後8時間ごと2日間にわたりサンプリングを行い、RNAを抽出し、それぞれの遺伝子の転写量を算出した。その結果、乳酸添加時にはトロホゾイト期以降のそれぞれの遺伝子の転写量の推移が遅延していくことが明らかとなった。(2)乳酸によるマラリア原虫の発育遅延の解析(1)で明らかとなった遺伝子転写の推移の変化の原因を探るため、ギムザ染色により原虫の形態を観察した。その結果、乳酸添加群で発育の遅延が認められた。この発育遅延はトロホゾイト期以降で顕著にみられ、このことが遺伝子の転写量に影響していることが考えられた。次に、マラリア原虫の発育に影響を与える乳酸の濃度について検討したところ、培養24時聞では20mMから、培養48時間では5mMから濃度依存的な発育遅延が認められた。さらに、高濃度乳酸存在下(30mMおよび60mM)のシゾント後期において、形成されたメロゾイト数を算出したところ、乳酸を添加していない群と比較して、有意にメロゾイト数が減少していた。以上の結果より、乳酸添加時には、乳酸脱水素酵素の活性低下に伴うピルビン酸の細胞内における蓄積が活性酸素分子種(ROS)を発生させているのではないかと考え、抗酸化剤であるアスコルビン酸の影響について調べた。その結果、アスコルビン酸は乳酸によって誘導されるマラリア原虫の発育遅延を抑制することが明らかとなった。以上の結果は、乳酸によるROSの発生が、発育遅延を誘導する要因の1つであることを示唆する。重篤なマラリア患者では、乳酸によるアシドーシスが深刻な問題となっており、今後、乳酸とマラリア原虫の発育の関係がさらに解明されれば、治療法の改善に役立つことが期待される。

本年度は、(1)マラリア原虫のエネルギー転換系遺伝子の転写調節因子の探索、および、(2)乳酸によるマラリア原虫の発育遅延の解析、においてそれぞれ以下に示す成果が得られた。(1)マラリア原虫のエネルギー転換系遺伝子の転写調節因子の探索前年度、マラリア原虫のin vitro培養系において、グルコース、乳酸や鉄の濃度、ジクロロ酢酸ナトリウ(DCA : ピルビン酸脱水素酵素キナーゼ阻害剤)の添加について検討した結果、乳酸がエネルギー代謝系遺伝子の転写を変化させることが予測された。この結果を受け、乳酸がマラリア原虫に与える影響についてreal-timePCRによるより詳細な解析を行った。解析には、解糖系3つ、TCA回路2つ、および、呼吸鎖4つの遺伝子を用い、乳酸(30mMおよび60mM)添加後8時間ごと2日間にわたりサンプリングを行い、RNAを抽出し、それぞれの遺伝子の転写量を算出した。その結果、乳酸添加時にはトロホゾイト期以降のそれぞれの遺伝子の転写量の推移が遅延していくことが明らかとなった。(2)乳酸によるマラリア原虫の発育遅延の解析(1)で明らかとなった遺伝子転写の推移の変化の原因を探るため、ギムザ染色により原虫の形態を観察した。その結果、乳酸添加群で発育の遅延が認められた。この発育遅延はトロホゾイト期以降で顕著にみられ、このことが遺伝子の転写量に影響していることが考えられた。次に、マラリア原虫の発育に影響を与える乳酸の濃度について検討したところ、培養24時聞では20mMから、培養48時間では5mMから濃度依存的な発育遅延が認められた。さらに、高濃度乳酸存在下(30mMおよび60mM)のシゾント後期において、形成されたメロゾイト数を算出したところ、乳酸を添加していない群と比較して、有意にメロゾイト数が減少していた。以上の結果より、乳酸添加時には、乳酸脱水素酵素の活性低下に伴うピルビン酸の細胞内における蓄積が活性酸素分子種(ROS)を発生させているのではないかと考え、抗酸化剤であるアスコルビン酸の影響について調べた。その結果、アスコルビン酸は乳酸によって誘導されるマラリア原虫の発育遅延を抑制することが明らかとなった。以上の結果は、乳酸によるROSの発生が、発育遅延を誘導する要因の1つであることを示唆する。重篤なマラリア患者では、乳酸によるアシドーシスが深刻な問題となっており、今後、乳酸とマラリア原虫の発育の関係がさらに解明されれば、治療法の改善に役立つことが期待される。