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環境微生物生態メカニズム解明のための迅速・簡便な生体高分子定量技術の開発と適用

快速简便的生物聚合物定量技术的开发和应用，阐明环境微生物的生态机制

基本信息

批准号：
11J05656
负责人：
竹村泰幸 (須藤泰幸)
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2013
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J05656/
关键词：
核酸定量 rRNA 分子量分画膜分子量分角膜

项目摘要

本研究では, 迅速・簡便にRNAを直接定量する技術の開発している。本年度は, 相対量を評価する方法から, 絶対量を評価する方法への定量方法の改良を行った。本研究で開発しているRNA直接定量技術は, 分子量分画膜を用いることによりrRNAと交雑したプローブと他のプローブを分画することを特徴とし, 蛍光修飾オリゴヌクレオチドプローブ(6～8kDa)が16S rRNA(約500kDa)との交雑により, 見かけ上高分子化した交雑物を分子量分画膜上に捕捉し, 回収するものである。この回収液について, プローブ由来の蛍光量からプローブ量を, RNA由来の吸光度からRNA濃度を測定することで, 絶対量ベースでの定量(copies/ng)を可能とした。これにより, 本手法と他の方法との比較も容易になるものと考えられた。また, 蛍光強度と吸光度の測定は, 紫外線透過型底面をもつ黒色プレートを使用し、モノクロメーター式プレートリーダーによるハイスループットな解析が可能となった。プローブとRNAの交雑のストリンジェンシーの制御を温度制御による調整から, より容易な変成剤の濃度調整を用いる方法に変更した。様々な変成剤を検討したところ, 本手法には尿素が適していることがわかった。尿素なしの場合と比べ, 適切な尿素濃度では, 標的のRNAと非標的のRNAから得られるシグナルの比が約5倍に向上した。このように, 変成剤を用いることにより, 特異性が向上した。本手法により複数種の同時検出を試みたところ, 廃水処理UASBグラニュール汚泥から抽出したRNAのうちのBacteriaとMethanosaetaceaeはそれぞれ38.5±4.5%, 29.4±5.8%と, 環境試料から抽出したRNAの定量に成功した。以上のように、本研究で開発した手法によって、既にFISH法等で用いられているプローブを利用し、環境試料から抽出したRNAの定量を行うための一連の流れを実証することができた。

This study aims to develop a rapid and simple technique for direct RNA quantification. This year, we will improve the quantitative methods of quantitative evaluation and quantitative evaluation. In this study, we developed a direct quantitative technique for RNA, which was characterized by the use of molecular weight separation membranes (MWSMPs) and the interaction between rRNA and 16S rRNA(6 - 8kDa) and 16S rRNA(about 500kDa). The amount of RNA in the sample solution is determined by the absorbance of the sample solution, and the amount of RNA in the sample solution is quantified by the absolute amount (copies/ng). This method is relatively easy to use. For the determination of UV intensity and absorbance, the UV transmission type of the bottom surface is used to determine the color of the black surface. The temperature of the RNA molecule is controlled by a method that is easy to adjust. This is the first time I've ever seen a woman in my life. The ratio of target RNA to non-target RNA is about 5 times higher than that of urea concentration. The difference between the two is that the difference between the two is that the difference between the two is not significant. The method was successful in detecting multiple species simultaneously, and in extracting RNA from UASB sludge and Methanosaetaceae, respectively, by 38.5± 4.5%, 29.4±5.8%, and in quantifying RNA from environmental samples. In this study, we developed a method to detect and quantify RNA using FISH.