環境微生物生態メカニズム解明のための迅速・簡便な生体高分子定量技術の開発と適用

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本研究では, 迅速・簡便にRNAを直接定量する技術の開発している。本年度は, 相対量を評価する方法から, 絶対量を評価する方法への定量方法の改良を行った。本研究で開発しているRNA直接定量技術は, 分子量分画膜を用いることによりrRNAと交雑したプローブと他のプローブを分画することを特徴とし, 蛍光修飾オリゴヌクレオチドプローブ(6～8kDa)が16S rRNA(約500kDa)との交雑により, 見かけ上高分子化した交雑物を分子量分画膜上に捕捉し, 回収するものである。この回収液について, プローブ由来の蛍光量からプローブ量を, RNA由来の吸光度からRNA濃度を測定することで, 絶対量ベースでの定量(copies/ng)を可能とした。これにより, 本手法と他の方法との比較も容易になるものと考えられた。また, 蛍光強度と吸光度の測定は, 紫外線透過型底面をもつ黒色プレートを使用し、モノクロメーター式プレートリーダーによるハイスループットな解析が可能となった。プローブとRNAの交雑のストリンジェンシーの制御を温度制御による調整から, より容易な変成剤の濃度調整を用いる方法に変更した。様々な変成剤を検討したところ, 本手法には尿素が適していることがわかった。尿素なしの場合と比べ, 適切な尿素濃度では, 標的のRNAと非標的のRNAから得られるシグナルの比が約5倍に向上した。このように, 変成剤を用いることにより, 特異性が向上した。本手法により複数種の同時検出を試みたところ, 廃水処理UASBグラニュール汚泥から抽出したRNAのうちのBacteriaとMethanosaetaceaeはそれぞれ38.5±4.5%, 29.4±5.8%と, 環境試料から抽出したRNAの定量に成功した。以上のように、本研究で開発した手法によって、既にFISH法等で用いられているプローブを利用し、環境試料から抽出したRNAの定量を行うための一連の流れを実証することができた。