樹木心材化過程における心材成分生合成能の組織空間的制御機構に関する研究

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研究課題の概要を述べると、樹木幹部の中心組織である心材が形成される移行組織における活動を組織化学的に理解するとの観点から、本組織の化学的性質の変化をもたらす心材成分の生合成経路に対する制御機構の変化を捉えるという事を研究の目標としてきた。本目的遂行にあたって、研究計画を作成した平成23年度での計画として予定した実験内容では、研究対象となるスギの心材における主要な化学成分であるノルリグナンの生合成経路の解明において鍵となる酵素であるアガサレジノール水酸化酵素の単離および機能的特性の解明を目標に据えた。研究の中心的実施項目となる樹木試料から酵素を単離するという行為は先駆的な研究内容である事から、本酵素の単離・精製に関して慎重に特徴付けを行った。2年度までの研究内容としては、樹木試料より効率的な酵素を抽出するための条件を検討する段階に特化して進行してきたことから、3年度目の研究内容はアガサレジノール水酸化酵素の単離・精製の達成という目標に絞って研究を実施した。本年度は、イオン交換カラムクロマトグラフィーおよび疏水カラムクロマトグラフィーでの詳細な精製条件を検討した。本酵素を安定的に精製するためには、pH7.0条件下で陰イオン交換カラムにより精製を行う事が重要である事が明らかとなった。また、疎水クロマトグラフィー担体の最適リガンドおよび開始バッファーの硫安濃度条件を検討した結果は、本酵素の精製には芳香族系の官能基を用いる事が出来ない事が明らかとなった。開始バッファー硫安濃度が100mMリン酸緩衝液(pH7.0)に1.7Mとなるよう硫安を加えた条件で、非芳香族系カラムを用いた精製にて精製度の高い画分を得る事が明らかとなった。これらの精製手法を組み合わせて精製した画分について、pHレンジpH5-pH8の等電点電気泳動とSDS-PAGEを組み合わせた二次元電気泳動により、良好な精製が行えた事が確認された。本酵素の効果的な精製手法を確立した。