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ウイルスに特異的な複製マシーナリーの構造基盤の解明と創薬への応用

阐明病毒特异性复制机制的结构基础及其在药物发现中的应用

基本信息

批准号：
11J06792
负责人：
小林幹
金额：
$ 1.22万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2013
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度はウマヘルペスウイルス由来のヘリカーゼ・プライマーゼ複合体の結晶化試料の調製に取り組んだ。前年度に作製したヘリカーゼ、プライマーゼそれぞれの遺伝子を含む組み換えバキュロウイルスを昆虫細胞Sf+に感染させることでヘリカーゼ・プライマーゼ複合体を発現させた。この中でも特にウマヘルペスウイルスに関しては他の2種と比べて比較的発現状況が良好であるが結晶化に持ち込むほどの量のタンパク質が得られないことが前年度の研究によりわかっていた。そこで発現条件の検討を行った。具体的には昆虫細胞Sf+に感染させるバキュロウイルス濃度の検討や感染時間の検討などを行ったが、発現量を改善することはできなかった。またウマヘルペスウイルスのヘリカーゼは単体で大量に発現することが前年度の実験で分かっていたため、ヘリカーゼ単体についても構造決定に取り組んだ。前年度の実験により全長のウマヘルペスウイルス由来ヘリカーゼは大量発現と高純度精製はできるものの結晶化しないことが分かっていた。そこで今年度は末端領域を削ったヘリカーゼのコンストラクトを作製し、その遺伝子を含むバキュロウイルスを作製して同様に昆虫細胞Sf+に感染させた。そして感染した昆虫細胞を用いてウェスタンブロットを行ったが、ヘリカーゼの発現を確認することはできなかった。また今年度はインフルエンザウイルスが宿主に感染する際に用いるタンパク質であるヘマグルチニンの細胞外ドメインの調製にも取り組んだ。インフルエンザウイルスのヘマグルチニンの遺伝子に細胞外分泌シグナル配列とヒスチジンタグの遣伝子を融合させた遺伝子を含む組み換えバキュロウイルスを作製し、昆虫細胞に感染させた。そして分泌タンパク質を含む培養上清からNiカラムを用いてヘマグルチニンを精製したところタンパク質の発現が確認された。今後大量発現と精製を行い、薬剤との共結晶化を行う。

This year, the preparation of crystallization samples of the complex was carried out. In the past year, the development of insect cell Sf+ complex was carried out. The results show that the crystallization of the two kinds of crystals is better than that of the other two kinds of crystals. The conditions for the development of the project are discussed. Specific insect cell Sf+ infection, concentration, infection time, detection, and detection A large number of structural decisions have been made in the past year. In the past year, the total length of the product has been reduced to a large amount, and the crystallization of the product has been reduced to a high purity. This year, the insect cell Sf+ is infected by the virus. Insect cells are infected with the virus and the virus is detected. This year, the host cells were isolated from the host cells and the host cells were isolated from the host cells. Insect cells are infected by the extracellular secretion and fusion of genes. The production of the protein is confirmed by the purification of the protein. In the future, a large number of products will be produced, refined and co-crystallized.