Dronpaを用いたライブイメージングによる細胞内G－アクチン濃度の時空間的測定

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本年度は、細胞内におけるG-アクチン濃度の空間分布を評価するための測定系として多点FDAP測定を行い、ラメリポディア形成時における細胞内G-アクチン濃度の空間分布を測定した。以下に成果内容を示す。ラメリポディア形成細胞における細胞内G-アクチン濃度分布の測定ラメリポディアは、先導端におけるアクチン重合を駆動力として細胞膜が押し出される事によって形成される突起構造である。ラメリポディアのF-アクチンは、先導端において盛んに重合し、後方で速やかに脱重合されG-アクチンが生成される。このようなアクチン重合・脱重合の空間的な差異によって、細胞内G-アクチン濃度分布にも勾配が生じている事が予想される。しかし、これまでにラメリポディアを伸ばしている細胞で細胞内G-アクチン濃度の空間分布を実測した報告は無く、空間的なアクチン重合・脱重合制御と細胞内G-アクチン濃度の相関関係は不明であった。そこで、ラメリポディアを伸ばしている細胞においてFDAP測定を多点的に行い、細胞内G-アクチン濃度の空間分布の評価を試みた。測定には活性型Racの強制発現により安定的にラメリポディアを形成するマウス神経芽細胞腫由来N1E-115細胞を用いた。Dronpa-アクチン、活性型Rac及びmCherryを共発現させたN1E-115細胞のラメリポディアに2点、細胞体に3点の関心領域を設定し、FDAP測定及びDronpa・アクチンとmCherryの蛍光強度の測定を行った。Dronpa-アクチン、mCherryの蛍光強度から各関心領域におけるGIF-アクチン総量及び体積を見積もり、FDAP測定によりG/F-アクチン比を求めた。さらに、これらの測定値から各関心領域のG-アクチン濃度を算出した結果、ラメリポディアの前後やラメリポディアと細胞体のG-アクチン濃度の分布との間に有意な差は見られなかった。この事から、ラメリポディアの局所的なアクチン重合・脱重合が細胞内G-アクチン濃度の空間分布に与える影響は極めて小さい事が明らかとなり、アクチン重合に対する細胞全体のG-アクチン濃度の重要性が示唆された。