精原幹細胞の内因的自己複製能維持機構の解明

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3年間の目標は、精原幹細胞独特な遺伝子発現抑制系と、この系が関与している遺伝子群の網羅的解析にある。網羅的解析として、Plzfと相互作用するタンパク質群をプロテオーム解析および、Plzfのゲノム上における結合領域を明らかにするために行うクロマチン免疫沈降-シークエンス解析を行うことを目標とした。HAタグ(クロマチン免疫沈降-シークエンス解析において使用)、SBPタグ(プロテオーム解析において使用)、Flagタグの3種類のタグ付きPlzfが発現することのできるベクターを構築した。まず、293FT細胞株に構築したベクタープラスミドをトランスフェクションし、実際にタグ付きのPlzfが発現するかどうかについて、ウエスタンブロット法を用いて確認した。確認後、SBPタグを利用して、抗SBP抗体を用いた免疫沈降実験を行った。その結果、実際にPlzfに結合しているタンパク質の沈降が見られ、免疫沈降実験系構築の確認をすることができた。さらに培養i系精原幹細胞(GS細胞)における、Plzfと相互作用するタンパク質の同定を目指して、GS細胞にタグ付きPlzfを発現させたいと考えた。しかしながら、GS細胞では、通常のトランスフェクションでは遺伝子導入が難しいことが知られている。そこで、構築したプラスミドを元に、タグ付きPlzfを発現させることのできるレンチウイルスベクターを構築した。構築したベクターを使用してレンチウイルスを産生し、ウイルス液の濃縮を行った。作製したレンチウイルスをGS細胞に感染させたところ、感染がセルソーターにより確認され、タグ付きPlzf発現GS細胞の作製に成功した。