小胞体レドックスネットワークを中心とする小胞体品質管理機構の解析

Stable細胞を用いた小胞体レドックス因子の相互作用因子の同定、細胞内レドックス状態の定量化技術の構築を中心に実験を行った。【Stable細胞を用いた小胞体レドックス因子の相互作用因子の同定】小胞体レドックスネットワークの全貌解明のために、これまで小胞体レドックス因子と相互作用する因子の網羅的探索を続けてきた。具体的には、培養細胞HEK293T細胞に各小胞体レドックス因子(タグ付き)をstableに発現させた細胞株を樹立し、タグに対する免疫沈降を行い、その相互作用因子を質量分析計で同定している。野生型だけでなく、レドックス依存的な相互作用を検出するための変異体もstable化している。これらの変異体に関して40系統近くを作成し、相互作用因子の探索を進め、これらの相互作用因子の網羅的探索を行っている。質量分析計で計測される強度情報を利用し、個々の因子の結合力の定量性も勘案し、ネットワーク構造を抽出し、個々のレドックス因子の機能解明を試みた。【内在性タンパク質のレドックス状態の検出・定量方法の確立と活用】質量分析計を用いて、小胞体レドックス因子のレドックス状態の情報を網羅的に検出・定量する方法の確立を目指している。レドックス状態の違うシステイン残基に、異なる質量を持つラベル体を修飾させ、質量差によって生じる質量分析計での検出の違いから、そのレドックス(酸化・還元)状態を検出する。レドックス因子のシステインを含むペプチド断片の各レドックス状態のトランジション情報を取得し、その情報をもとに、現在細胞内のレドックス因子のレドックス状態を定量的に検出することを試みた。今後本手法を用い、小胞体レドックス維持機構の動態を具体的に把握する手法として確立する必要がある。

Stable細胞を用いた小胞体レドックス因子の相互作用因子の同定、細胞内レドックス状態の定量化技術の構築を中心に実験を行った。【Stable細胞を用いた小胞体レドックス因子の相互作用因子の同定】小胞体レドックスネットワークの全貌解明のために、これまで小胞体レドックス因子と相互作用する因子の網羅的探索を続けてきた。具体的には、培養細胞HEK293T細胞に各小胞体レドックス因子(タグ付き)をstableに発現させた細胞株を樹立し、タグに対する免疫沈降を行い、その相互作用因子を質量分析計で同定している。野生型だけでなく、レドックス依存的な相互作用を検出するための変異体もstable化している。これらの変異体に関して40系統近くを作成し、相互作用因子の探索を進め、これらの相互作用因子の網羅的探索を行っている。質量分析計で計測される強度情報を利用し、個々の因子の結合力の定量性も勘案し、ネットワーク構造を抽出し、個々のレドックス因子の機能解明を試みた。【内在性タンパク質のレドックス状態の検出・定量方法の確立と活用】質量分析計を用いて、小胞体レドックス因子のレドックス状態の情報を網羅的に検出・定量する方法の確立を目指している。レドックス状態の違うシステイン残基に、異なる質量を持つラベル体を修飾させ、質量差によって生じる質量分析計での検出の違いから、そのレドックス(酸化・還元)状態を検出する。レドックス因子のシステインを含むペプチド断片の各レドックス状態のトランジション情報を取得し、その情報をもとに、現在細胞内のレドックス因子のレドックス状態を定量的に検出することを試みた。今後本手法を用い、小胞体レドックス維持機構の動態を具体的に把握する手法として確立する必要がある。