金属ナノ粒子－タンパク質複合体の生体内一段階調製プロセスの開発

本研究では、グリセロールデヒドロゲナーゼ(GLD)によるNADH補酵素再生系に対して、金結合性ペプチドを融合した機能性タンパク質を共存させることで、目的とする機能性タンパク質が金ナノ粒子表面に修飾された金ナノ粒子-タンパク質複合体の調製を試みた。まず、3つの異なる機能(精製用タグとしてヘキサヒスチジンタグ(His-tag)およびグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、抗体結合ドメインとしてプロテインGおよびプロテインA、金結合ペプチドとしてA3ペプチド)を有する機能性タンパク質をデザインした。また、各ドメインが金ナノ粒子の形成や結合に与える影響を評価するために、A3ペプチドを欠損させたタンパク質および精製用タグを欠損させたタンパク質も調製し、評価に用いた。その結果、抗体結合ドメイン融合タンパク質存在下においてもGLD酵素反応による金ナノ粒子合成反応は進行し、生成した金ナノ粒子表面に当該融合タンパク質が結合していることを確認した。さらに、得られた抗体結合ドメイン修飾金ナノ粒子を用いたEnzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)の結果から、金ナノ粒子上に固定化された融合タンパク質は、金結合性ペプチドを介してその機能を保持した状態で金ナノ粒子上に固定化されていることが明らかとなった。さらに、大腸菌由来GLDに代え、より安定で結晶構造が入手可能なBacillus stearothermophlius由来GLD (BsGLD)を用いてタンパク質修飾金ナノ粒子の調製を試みた。BsGLDの高次構造情報を基に、機能性タンパク質と金結合ペプチドの双方を遺伝子工学的手法により融合させた新規キメラタンパク質を調製することで、単一タンパク質成分によるタンパク質修飾金ナノ粒子の一段階合成を試みた。その結果、金ナノ粒子合成と粒子表面への提示を一種類の融合タンパク質が担う金ナノ粒子-タンパク質複合体の調製に成功した。また、本手法により調製された金ナノ粒子上に固定されたタンパク質の機能が十分に保持されていることをELISAにより確認した。

本研究では、グリセロールデヒドロゲナーゼ(GLD)によるNADH補酵素再生系に対して、金結合性ペプチドを融合した機能性タンパク質を共存させることで、目的とする機能性タンパク質が金ナノ粒子表面に修飾された金ナノ粒子-タンパク質複合体の調製を試みた。まず、3つの異なる機能(精製用タグとしてヘキサヒスチジンタグ(His-tag)およびグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、抗体結合ドメインとしてプロテインGおよびプロテインA、金結合ペプチドとしてA3ペプチド)を有する機能性タンパク質をデザインした。また、各ドメインが金ナノ粒子の形成や結合に与える影響を評価するために、A3ペプチドを欠損させたタンパク質および精製用タグを欠損させたタンパク質も調製し、評価に用いた。その結果、抗体結合ドメイン融合タンパク質存在下においてもGLD酵素反応による金ナノ粒子合成反応は進行し、生成した金ナノ粒子表面に当該融合タンパク質が結合していることを確認した。さらに、得られた抗体結合ドメイン修飾金ナノ粒子を用いたEnzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)の結果から、金ナノ粒子上に固定化された融合タンパク質は、金結合性ペプチドを介してその機能を保持した状態で金ナノ粒子上に固定化されていることが明らかとなった。さらに、大腸菌由来GLDに代え、より安定で結晶構造が入手可能なBacillus stearothermophlius由来GLD (BsGLD)を用いてタンパク質修飾金ナノ粒子の調製を試みた。BsGLDの高次構造情報を基に、機能性タンパク質と金結合ペプチドの双方を遺伝子工学的手法により融合させた新規キメラタンパク質を調製することで、単一タンパク質成分によるタンパク質修飾金ナノ粒子の一段階合成を試みた。その結果、金ナノ粒子合成と粒子表面への提示を一種類の融合タンパク質が担う金ナノ粒子-タンパク質複合体の調製に成功した。また、本手法により調製された金ナノ粒子上に固定されたタンパク質の機能が十分に保持されていることをELISAにより確認した。