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原口から脊索を生み出した進化過程のＣｈＩＰ－ｓｅｑ法を用いた解析

使用 ChIP-seq 方法分析从胚孔产生脊索的进化过程

基本信息

批准号：
12J09531
负责人：
安岡有理
金额：
$ 2.32万
依托单位：
Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12J09531/
关键词：
脊索原口進化発生転写制御 brachyury ChIP-seq RNA-seq

项目摘要

１）サンゴ胚に薬剤処理を施し、Wnt/β-cateninシグナルを活性化したところ、brachyuryの発現が活性化され、外胚葉全体に発現が広がった。一方、Wnt/β-cateninシグナルを抑制したところ、brachyuryの発現が弱まるもしくは消失した。さらに、サンゴbrachyuryの上流約1 kbをクローニングし、Xenopus胚を用いてLuciferase reporter assayを行った結果、サンゴTcfによってレポーターの発現が制御されることが示された。２）Xenopus特異的な二つのbrachyuryパラログ遺伝子brachyury（主に尾芽に発現）およびbrachyury2（主に脊索に発現）のエンハンサー候補配列の活性について、トランスジェニックレポーター解析を行った。その結果、brachyury U1領域は脊索とともに体節でもエンハンサー活性を持つが、U2領域と組み合わせることで体節でのレポーター遺伝子の発現は弱まり、脊索での発現がより顕著になることが示された。一方、brachyury2のU1領域は体節でのエンハンサー活性が弱く、脊索でのエンハンサー活性が強かった。このU1領域の活性の違いが、二つの遺伝子機能の分化に寄与した可能性が高い。さらに、各brachyury機能阻害胚のRNA-seq解析を行った結果、Brachyury2特異的な標的遺伝子候補として、脊索細胞の液胞化や細胞形態に関わる遺伝子が多く見つかった。３）サンゴbrachyuryの機能阻害胚を用いたRNA-seq解析の結果同定された標的遺伝子候補のうち、brachyury機能阻害胚で発現の減少した遺伝子は原腸胚期で主に外胚葉で発現しており、逆に機能阻害胚で発現が増加した遺伝子は内胚葉で発現することが示された。これは、サンゴBrachyuryが原口において外胚葉と内胚葉の分化のバランスを制御していることを示唆している。４）Xenopus Brachyury2およびホヤBrachyuryの抗原を精製するため、FLAGタグを用いたところ、これまでのGST融合タンパク質よりも安定して大腸菌内で発現させられることがわかった。

1) Suppressant treatment and activation of Wnt/β-cateninたところ、brachyuryの発appearがactivationされ、ectodermal leaf whole body に発appearが広がった. One side, Wnt/β-catenin シグナルを inhibits したところ, brachyury の発appears が weak まるもしくはした. Luciferase reporter assayを行った結果、サンゴTcfによってレポーターの発現が制御されることが示された。 2) Xenopus's unique な二つのbrachyuryパラログ伝子brachyury (main に tail sprout に発appear) およびbra chyury2 (main に chord に発appear) のエンハンサー candidate arrangement のActivity について, トランスジェニックレポーターanalytic を行った.そのRESULT, brachyury The U1 field is the chord and the body section is active, and the U2 field is the group and the joint is the same. The body segments are clear and the spine is clear, and the notochord is clear and clear. One party, brachyury2のU1 field's body section's active and weak, notochord's active and strong. The activeness of the U1 field is illegal, and the differentiation of the functions of the two leftovers is high and the possibility is high.さらに、Results of RNA-seq analysis of each brachyury function-impaired embryo, Brachyury 2. The specific target candidate is the leucocytosis of the notochord cells and the cell morphology of the leucocytosis. ３) The results of RNA-seq analysis of embryos with functional impairment of brachyury are the same as those of the target candidates, functional impairment of brachyury. The main part of the embryo is the main part of the gastrula embryo and the ectodermal part is the main part of the embryo. The function of the embryo is to prevent the growth of the endodermal leaf and the growth of the endodermal leaf.これは、サンゴBrachyuryがharaguchiにおいてectodermal leaf and endodermal leaf のdifferentiation のバランスをcontrol していることをshows している. 4) Xenopus Brachyury2およびホヤBrachyuryのantigenをrefinedするため、FLAGタグを用いたところ、これまでのGST fusion タンパク性よりも stabilization して coliform inner で発appears させられることがわかった.